免疫沉淀试剂盒(Protein A琼脂糖)

产品货号：

GS4779

中文名称：

免疫沉淀试剂盒(Protein A琼脂糖)

英文名称：

Immunoprecipitation Kit,Protein A Agarose

产品规格：

20次

发货周期：

1～3天

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免疫沉淀可以通过特异性抗体和结合抗体的基质，从复杂的蛋白混合物中特异性的纯化蛋白质，然后可以通过离心从混合物中分离出经特异性抗体结合蛋白的基质。本试剂盒使用的基质是琼脂糖结合Protein A。IP之后是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），IP常用于测量蛋白质抗原的分子量，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，测定特异性酶活性，监测蛋白质表达后的修饰，确定蛋白质的存在和数量等。IP技术还能够检测罕见的蛋白质，因为IP可以将其浓缩至高达10000倍，一般方法难以检测。

产品特点

为准备细胞/组织提取物，抗原结合，洗脱步骤提供最优化的缓冲液。
试剂盒中提供的Protein A琼脂糖beads可以更好的与抗体FC段结合。
可用于功能性实验，例如蛋白质或者蛋白质复合物的IP/Co-IP。

组分	规格
10×裂解缓冲液	10mL
PMSF	0.6mL
10×IP缓冲液	50mL
10% SDS	5mL
5M NaCl	10mL
Protein A-琼脂糖	0.4mL
20×PBS	20mL
1×上样缓冲液	1mL
柱、管、盖	20套

保存：Protein A-琼脂糖需要在4℃保存，不可冻存。PMSF和1×上样缓冲液需要在-20℃保存，其他产品保存在室温即可，保质期24个月。

操作步骤

准备：加入18μL（指琼脂糖树脂体积，若加混悬液需加36μL）Protein A-琼脂糖到含有过滤片的柱子中，去掉盖子（不要丢弃盖子，将在第10步骤使用），加入700μL的1×PBS洗涤琼脂糖，低速离心，洗四次后琼脂糖即可使用。
在5×10⁶～1×10⁷细胞培养物中，在4℃下以800rpm离心3min，收集细胞。去除上清并用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次。每次洗涤时以800rpm旋转3min。完全去除PBS并保留细胞沉淀。每100mg细胞沉淀加入1mL用双蒸水稀释后的1×裂解缓冲液，漩涡搅拌，用玻璃匀浆器匀浆30～50次或超声处理30sec，间隔1min，重复操作3次。然后以12000rpm离心5min，收集上清液作为细胞裂解物。
在新的微量离心管中加入0.7mL细胞裂解物，7μL PMSF和1μg的纯化抗体。
在平台上4℃孵育1h至过夜。
孵育后，将细胞裂解液物移到装有洗涤过的Protein A-琼脂糖柱中。
在平台上4℃孵育2h至过夜。
将每个柱子中插入转移到提供的2mL的新微量离心管中。
4℃，12000rpm离心旋转30sec。
去掉上清，用700μL 1×IP缓冲液洗涤沉淀琼脂糖珠子6次，然后用700μL 0.1×IP缓冲液清洗珠子1～2次，以12000rpm离心柱子30sec。
加入40～50μL 1×上样缓冲液，轻轻混合珠子（无涡旋）。
用盖子密封柱子。
在95℃加热5min，用薄纸或滤纸吸干盖子周围的水。
打开柱盖，将柱子插入到新的微量离心管中，以12000rpm离心30sec，洗脱的免疫沉淀物可用于SDS-PAGE。

1×细胞裂解缓冲液可用于大多数细胞裂解过程（如果需要，可向其加入200:1比例的10% SDS）。
细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂（如PMSF，抑肽酶）是至关重要的。
在处理非特异性结合时，洗涤的次数和类型非常重要。
当需要彻底清除SDS时，可以用1×PBS代替0.1×IP缓冲液。
为了减少非目的细胞蛋白与Protein A-琼脂糖的非特异性吸附质，预先清除非特异性吸附的步骤非常重要。
- 加入18μL Protein A-琼脂糖悬浮液（可以加入1μg对照IgG）到细胞提取液中。
- 将样品转移到微量离心管中，摇床4℃孵育1h。
- 以12000rpm离心30sec将琼脂糖珠粒沉淀，并将上清液收集到干净的管中。
- 样品现已通过预先清除，可以进行免疫沉淀。

当观察到蛋白质的非特异性吸附时，有必要通过如下表格中加入盐或SDS的方法，改变洗涤方案，提高洗涤条件的严苛性。

	Option 1	Option 2	Option 3
First 2 Washes	1×IP缓冲液/0.5M NaCl	1×IP缓冲液/0.5M NaCl/0.1% SDS	1×IP缓冲液/0.1%SDS
Next 4 Washes	1×IP缓冲液	1×IP缓冲液	1×IP缓冲液
Last 1 Washes	0.1×IP缓冲液/PBS	0.1×IP缓冲液/PBS	0.1×IP缓冲液/PBS

若Protein A-琼脂糖不能有效地结合特异性抗体，可以用Protein A/G Plus或在特异性抗体与Protein G-琼脂糖之间加入桥连抗体。
- 用1×PBS洗涤Protein A-琼脂糖珠两次。
- 加入5～10μL桥连抗体，并在室温下孵育30min至1h。
- 用1×PBS洗两次。Protein A-琼脂糖即可使用。

没有信号或信号很弱
- 为了降低样品在制备过程中抗原降解的可能性，加入蛋白酶抑制剂。
- 增加抗体的浓度，延长孵育时间。
- 缩短洗涤时间，使用温和的洗涤缓冲液（不含洗涤剂）。
- 延长Protein A-琼脂糖的孵育时间（过夜）。
- 检查抗体对Protein A-琼脂糖的亲和力，如果结合亲和力低，则改变基质（Protein A/G琼脂糖，Protein A-琼脂糖，或加入桥连抗体）。
- 增加凝胶电泳的蛋白上样量。
- 检查印迹有效性。更改印迹条件，缓冲液等。
- 检查检测系统或延长检测时间。
背景太大
- 增加预清除步骤的吸收倍数，去除所有非目的蛋白与Protein A-琼脂糖的非特异性吸附。
- 增加抗体-Protein A-琼脂糖复合物的洗涤时间，或增加洗涤的严苛性。
- 避免与膜接触，使用干净的设备，新缓冲液和新膜。
- 稀释样品中的蛋白质浓度，降低抗体浓度。

Protein A和Protein G和Protein A/G对不同抗体的结合能力

种属	亚型	Protein A结合力	Protein G结合力	Protein A/G结合力
Human	IgA	variable	—	++
	IgD	—	—	—
	IgE	—	—	—
	IgG1	++++	++++	++++
	IgG2	++++	++++	++++
	IgG3	—	++++	++++
	IgG4	++++	++++	++++
	IgGM	variable	—	++
Avian egg yolk	IgY	—	—	—
Cow		++	++++	++++
Dog		++++	++	++++
Goat		—	++++	++++
Guinea pig	IgG1	++++	++	++++
Guinea pig	IgG2	++++	++	++++
Hamster		+	++
Horse	Total IgG	++	++++	++++
Koala		—	+
Liama		—	+
Mouse	IgG1	+	++++	++
	IgG2a	++++	++++	++++
	IgG2b	+++	+++	+++
	IgG3	++	+++	+++
	IgM	variable	—	—
Monkey(rhesus)		++++	++++	++++
Pig		+++	+++	++++
Rabbit	Total IgG	++++	+++	++++
Rat	IgG1	—	+	++
	IgG2a	—	++++	++++
	IgG2b	—	++	++
	IgG3	+	++	++
Sheep	Total IgG	+/-	++	++

++++：结合能力强
++：结合能力中等
+：结合能力弱
—：没有结合能力
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