产品货号：
GS4722
中文名称：
Western Blot试剂盒(小鼠,带PVDF膜)
英文名称：
Western Blot Kit(Mouse)with PVDF membrane
产品规格：
100次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒包含了转膜，封闭，酶标二抗，显色等相关试剂，客户只需自备一抗即可进行WB实验，方便快捷。
保存：4℃，二抗及DAB请置于-20℃长期保存，避免反复冻融，有效期2年。
一、转膜：
二、免疫印迹：
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| 组分 | 规格 |
| 转膜混合物 | 5×1瓶 |
| 10×丽春红 | 20mL |
| 封闭剂 | 5×1瓶 |
| Tween-20 | 2mL |
| 20×PBS | 2×125mL |
| 20×TBS | 2×125mL |
| HRP标记兔抗小鼠IgG | 100μL |
| DAB | 5×1支 |
| 10×DAB显影溶液 | 10mL |
| H2O2 | 1mL |
| 热封袋 | 20个 |
| PVDF膜(10×10cm) | 5张 |
保存：4℃，二抗及DAB请置于-20℃长期保存，避免反复冻融，有效期2年。
一、转膜：
- 准备转膜缓冲液：加入一个准备好包装的转膜混合物和200mL甲醇（如果需要），去离子水定容至1000mL。
- 切割滤纸和膜，用甲醇预处理的PVDF膜，将膜漂浮去离子水表面，直到其从下方开始完全润湿。
- 凝胶电泳完成后，从电泳室取出凝胶，切下含蛋白条带的凝胶。在凝胶右下角做一个小切口。
- 将凝胶浸入转移缓冲液中20分钟，将膜和滤纸也浸入转移缓冲液中。
- 用海绵和3张滤纸放置一个支架，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
- 将凝胶放置在滤纸上，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
- 将膜放置在凝胶的上面。在膜的右下角做一个小切口，以匹配凝胶右下角的切口，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
- 将3张滤纸放置在膜上面，压出气泡。
- 在滤纸上方放置海绵，夹上转膜三明治。
- 将三明治置于转移室中，装满转膜缓冲液，确保膜面向正极方向。
- 进行转膜。
- 打开盒子，从膜上取出凝胶（凝胶可以用考马斯亮蓝染色来观察转印效率）。膜可以用丽春红染色10分钟，并用去离子水洗涤。
二、免疫印迹：
- 制备封闭液：向100mL 1×TBS中加入一袋备好的封闭剂。
- 将膜放在热封袋中，每平方厘米膜加入0.1～0.2mL封闭液，，尽可能地挤出空气，密封袋子，放在摇床上室温震荡1小时。
- 切下热封袋的一角，排出封闭液。
- 每平方厘米膜加入0.1～0.2mL封闭液，加入适当浓度的抗体，尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置1小时（或4℃摇床上过夜）。
- 在摇床上用PBST（PBS中含0.05%Tween）洗涤膜5分钟，重复3次。
- 用TBS洗涤膜10分钟，每平方厘米的膜加入0.1～0.2mL封闭液，加入适当浓度的酶标二抗（1:2500～50000），尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置1小时。
- 在摇床上用TBST（0.05%吐温）洗涤膜5分钟，重复3次。在TBS中再洗一次。
- 制备DAB底物溶液：
- 将一包DAB溶于10mL 1×DAB显影溶液中。
- 加入10μL过氧化氢。
- 将一包DAB溶于10mL 1×DAB显影溶液中。
- 印迹反应显色。
- 预期条带出现后停止反应，倒出溶液并反复用蒸馏水冲洗。将膜干燥并置于黑暗中。
- 使用适当的手套，干净的的手术刀和钝头镊子来处理膜。膜和滤纸应比凝胶大约1mm。
- PVDF膜使用前需要用甲醇处理。
- 安装转印三明治时，每一步都需要用玻璃棒赶出所有气泡。
- 推荐稀释HRP标记二抗的浓度是1:2500～50000，如果印迹之后将用ECL或高背景观察，则二抗应进一步稀释（＞1:100000）。
- 在封闭好印迹步骤中，空气应尽可能从热封袋中挤出。
- 不要在印迹过程中立即使用膜，应彻底干燥并在室温下保存。
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