Ni-NTA琼脂糖树脂

产品货号：

GS4388

中文名称：

Ni-NTA琼脂糖树脂

英文名称：

Ni-NTA Beadose Resin

产品规格：

10mL|25mL|100mL|250mL

发货周期：

1～3天

产品价格：

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Ni-NTA琼脂糖纯化树脂是以6%交联的琼脂糖为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA）螯合镍离子（Ni²⁺）后的产品，性质更加稳定，可以纯化组氨酸标签蛋白。Ni-NTA树脂可用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等）的组氨酸标签蛋白的纯化。在含组氨酸标签的重组蛋白表达后，可以利用变性或非变性条件对目的蛋白进行纯化，已经连接到树脂上的蛋白可以用低pH溶液、咪唑溶液洗脱。

技术参数：
平均粒径：90μm
蛋白结合能力：约10～40mg组氨酸标签蛋白/1mL树脂
兼容性：在所有常用的缓冲液、变性剂和去污剂中稳定
填料中的影响因子：螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸，组氨酸等。
酸碱稳定性：短期（2h）pH2～14（基质测试）
储存缓冲液：20%乙醇
储存温度：4～8℃不可冻存

Ni-NTA纯化树脂的兼容性：

类别	试剂	浓度
还原剂	DTE	5mM
	DTT	0.5～1mM
	β-mercaptoethanol	20mM
	TCEP	5mM
	Reduced Glutathione	10mM
变性剂	Urea	8M
变性剂	Guanidine-HCl	6M
去污剂	Tween 20	2%
	TritonX-100	2%
	Np-40	2%
	CHAPS	2%
其他添加剂	Ethanol	20%
	Glycerol	50%
	Na2SO4	0.1M
	NaCl	1.5M
	EDTA	0.2～1mM
	EGTA	0.2mM
	Citrate	60mM
缓冲液	Sodium Phosphate (pH7.4)	50mM
	Tris-HCl（pH7.4）	0.1M
	Tris-acetate（pH7.4）	0.1M
	HEPES（pH7.4）	0.1M
	MOPS（pH7.4）	0.1M
	Sodium Acetate (pH7.4)	0.1M

注：

为了利于纯化，按照下列操作步骤对填料进行预清洗，同时注意样品液中尽量避免使用还原剂。
若样品粘度较高的情况下请在室温下进行。
螯合剂应小心使用（而且只能用于样品中，不能用于纯化Buffer中）。在离心或过滤之前，为了抵消螯合剂对金属离子的脱落，可以稍加MgCl₂。

推荐的缓冲液：

非变性条件：
Binding/Wash Buffer（含10mM咪唑），选购货号：GS4633
Elution Buffer（含250mM咪唑）：选购货号：GS4634
变性条件:
Binding/Wash Buffer：20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，5mM咪唑，pH8.0
Elution Buffer：20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0

注意事项：

为了获得更多量和更高纯度的蛋白，需要确定最适咪唑浓度，不同蛋白是不同的。一般平衡缓冲液（Binding/Wash Buffer）20～40mM咪唑可适用于大部分蛋白但可能会降低蛋白与树脂的结合能力，洗脱缓冲液（Elution Buffer）500mM咪唑通常能将目的蛋白全部洗脱，建议初次洗脱进行咪唑梯度洗脱，以确定最适咪唑洗脱浓度，250mM咪唑为大部分蛋白的最适洗脱浓度。
在20mM咪唑存在下的蛋白上清液可以增加特异性，减少非特异性结合。但是如果在此浓度下标签蛋白不能和树脂结合，可以适当减少咪唑浓度到5～10mM或是在刚开始纯化时不加入咪唑。
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤已减少杂质对填料的影响。

一、样品准备：

组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌中非变性条件下可溶性表达）
- 稀释：每克大肠杆菌菌体加入5～10mL Binding/Wash Buffer重悬，样品和Binding/Wash Buffer中含同样浓度的咪唑可以避免宿主细胞表达的蛋白质与暴露的组氨酸标签相结合。同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、柠檬酸等杂质，防止破坏Ni-NTA树脂。
- 酶解：加入0.2mg/mL溶菌酶，20μg/mL DNase，1mM MgCl₂，终浓度1mM PMSF或其他蛋白酶抑制剂，注意加入的抑制剂必须对镍柱没有影响，4℃振荡混匀30min。
- 机械裂解：超声，均质，反复冻融等或其他类似技术。
- 调整裂解液的pH至7.4，注意不要用强酸强酸调节pH（防止蛋白沉淀）。
- 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4℃，12000rmp离心20min，温度的选择取决于蛋白的稳定性。
- 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。
- 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量体积的上清液可以用硫酸铵沉淀法进行蛋白浓缩，再用1X PBS透析换液后加入到柱中，如果样品中不含EDTA，组氨酸，柠檬酸等影响柱子的成分，可以直接上柱。
- 如果在细胞质中表达蛋白质，可选用我司生产的（GS1535昆虫细胞蛋白裂解液，GS1420动物细胞蛋白裂解液，GS1423酵母蛋白裂解液）试剂盒或参考相关文献。将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash Buffer混合制备样品，其它配方的Binding/Wash Buffer可以根据经验确定。
注：也可以将样品直接上柱（省略以上步骤）。如果直接上柱，延长机械裂解时间，例如超声10min。样品粘度越高纯化所需的总时间越长。
组氨酸标签蛋白样品准备（在大肠杆菌中包涵体表达变性条件纯化）
- 用1X PBS悬浮细胞（每mL细菌沉淀需要约5mL的1X PBS），按照上面的超声条件进行实验。
- 裂解液在12000rpm离心10min收集包涵体，用1X PBS洗涤2～3次包涵体。
- 将变性条件下加入含有变性剂的Binding/Wash Buffer（每mL包涵体需要约5mL的Binding/Wash Buffer），并在室温下孵育30～60min，可能需要均质或超声将沉淀完全溶解。
- 12000rpm离心30min以去除剩余的不溶物沉淀，小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。

二、纯化步骤：

离心法组氨酸标签蛋白纯化步骤：
可根据自身实验情况进行调整，可以在室温或是4℃进行纯化。
- 加入适量的Ni-NTA树脂到离心管中，离心管在3000rpm离心2min然后小心的去除上清（保持低速离心，以免损坏柱料）。
- 加入两倍柱体积的Binding/Wash Buffer将缓冲液和树脂完全混匀平衡柱料。
- 再将离心管在3000rpm离心2min然后小心去除上清。
- 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀或直接上柱，使混合液总体积相当于两倍树脂体积。
- 将上步中的样品混合液加入树脂中，再旋转振荡混匀30min，使混合液与树脂充分混匀。
- 将离心管在3000rpm离心2min，吸出上清，如需要可将上清留存进行下游分析。
- 用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer清洗，再将离心管在3000rpm离心2min吸出上清，如需要可将上清留存进行下游分析。
- 重复清洗步骤，通过测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值。
- 用一倍树脂体积的Elution Buffer洗脱树脂上的组氨酸标签蛋白，将离心管在3000rpm离心2min，然后小心的吸出并保存上清。此步骤重复两次，将每次的洗脱液分别保存。
- 通过测量在280nm处吸光度或用我司产的改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒（GS1482）或改良型BCA法蛋白浓度测定试剂盒（GS1483）确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。
重力法组氨酸标签蛋白纯化步骤（需要进行额外装柱处理）
可根据自身实验情况进行调整，可以在室温或4℃进行纯化。
- 根据需求载量取一根相应规格Ni-NTA预装柱，将存储缓冲液通过重力流出。
- 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，使用0.5～1mL/min流速，使Buffer缓慢排出树脂。
- 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀制备样品液，使样品液的总体积是柱体积的两倍。
- 将样品液加入柱子上，收集流穿液到离心管中。如有多余样品可再次上样，重新流通一次可提高样品与填料的结合力。
- 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液在280nm处吸光度接近基线。
- 用两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，此步骤重复2次，每次的洗脱液分别储存，直到洗脱液在280nm处吸光度接近基线。
- 柱料后处理：用5倍体积Elution Buffer洗脱柱料，再用5倍体积Binding/Wash Buffer平衡柱料，最后用5倍体积ddH2O清洗柱料，加入20%乙醇保护液，置于2～8℃保存，不可冻存。
- 通过测量在280nm处吸光度或用我司产的改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒（GS1482）或改良型BCA法蛋白浓度测定试剂盒（GS1483）确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。
注：
- 可用凝胶过滤的方法（GS1466重力型去盐柱）或透析法去除咪唑。如进行SDS-PAGE，样品中含6M盐酸胍时必须透析到8M尿素中。
- 如想得到更好的纯化效果，请适当延长样品与树脂结合的孵育时间。
- 以上柱体积特指柱料体积。
- 填料反复使用建议用于同种蛋白的纯化，以防污染。

在位清洗：
如果观察到液体流速很慢或显着的树脂污染，可使用在位清洗，通常会使树脂完全恢复性能。我们建议使用以下方法去除污染物如蛋白质沉淀，疏水蛋白和脂蛋白。

在位清洗步骤：

用15倍柱体积的0.5M的NaOH清洗树脂，最好在30min内清洗完毕并适当调整流量（如用0.5M的NaOH清洗1mL Ni-NTA树脂，流速为0.5mL/min，总体积为15mL）。
用10倍柱体积的1X PBS重新平衡，平衡好的树脂可进行纯化实验或用20%的乙醇储存留用。

注：若需长时间在位清洗或处理大量树脂时建议先将Ni²⁺脱掉（可参照再生步骤），再进行在位清洗步骤，清洗完成后再挂Ni²⁺，保存到20%的乙醇中。

树脂再生：
通常再生是不需要的，如果观察到液体流速很慢或显着的树脂污染，可使用在位清洗，通常会使树脂完全恢复性能。若效果不能令人满意，树脂就需要进行再生。

再生步骤：

用10倍柱体积的Stripping Buffer（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，100mM EDTA，pH8.0）进行清洗。
用10～20倍柱体积去离子水清洗树脂。
用5倍柱体积的100mM NiSO4（溶解于去离子水中）洗涤树脂。
用10倍柱体积的1X PBS重新平衡，平衡好的树脂可进行纯化实验或用20%的乙醇储存留用。

常见问题：

流速很慢
- 样品粘性太大
  - 纯化的时候可以将温度从4℃变为室温。
  - 如果可能的话，增加超声前细胞浆的稀释度或超声后细胞浆的稀释度。
  - 继续处理直到降低粘度，可额外加入DNase I和Mg²⁺，过滤或离心样品。
  - 如果液体非常粘稠也可以通过连接真空泵加快流速。
- 目标蛋白难溶或是在纯化过程中蛋白产生了沉淀
  - 添加洗涤剂或其他添加剂，轻轻搅拌30min，以帮助标记蛋白溶解。
    注意：Triton X-100和Np-40（不是Tween）在280nm有最高吸收峰，另外洗涤剂不易被透析。
  - 针对包涵体：蛋白质通常可以从包涵体中溶解（变性），常见的变性剂如4~6M盐酸胍，4~8M尿素或强洗涤剂，轻轻搅拌30min以上有助于蛋白质的溶解。
组氨酸标签蛋白量少
- 组氨酸标签没有被完全洗脱
  - 再次加入洗脱Buffer进行洗脱或增加咪唑浓度最高至500mM。
- 在样品流穿液中有组氨酸标签蛋白
  - 样品缓冲液中咪唑含量过高，用低浓度咪唑，确保样品中的螯合剂或还原剂浓度。
  - 组氨酸标签可能没有暴露出来。
  - 用尿素或盐酸胍将包涵体蛋白变性，为防止样品被稀释可加入固体的尿素或盐酸胍。
  - 组氨酸标签可能已经缺失，检查基因序列。
- 组氨酸标签蛋白没有被洗脱下来
  - 组氨酸标签蛋白仍然在柱子上。
  - 洗脱时用更高浓度的咪唑溶液。
  - 标签蛋白可能在柱子内沉淀。
  - 可减少样品量。
  - 洗脱过程中咪唑浓度变低。
  - 可以尝试用适量非离子去污剂或改变NaCl浓度，或是在变性条件下进行洗脱。
  - 非特异性疏水作用或其他作用，向洗脱缓冲液中添加非离子型去污剂或增加NaCl浓度。
洗脱出的组氨酸标签蛋白不纯
- 在样品和BindingBuffer混合液中，咪唑浓度太低
  - 在样品和Binding Buffer混合液中用更高浓度的咪唑浓度，浓度20～40mM是推荐浓度，但是更高的浓度可能也是可以的。
- 洗涤不够
  - 重复洗涤步骤以获得最佳纯度。
- 标签蛋白可能降解
  - 加入蛋白酶抑制剂（避免EDTA），并在4℃进行操作。
- 杂蛋白可能是标签蛋白产生相互作用
  - 在超声处理细胞之前可增加洗涤剂的水平（例如2% Triton X-100和2%吐温-20），或添加50%甘油的洗涤液可破坏非特异性相互作用。

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