产品货号：
GS1586
中文名称：
Western检测试剂盒(适用于兔源一抗)
英文名称：
WB kit for rabbit primary antibody
产品规格：
5T|10T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒适用于宿主为兔的一抗实验系统，具有使用方便、操作简单、检测灵敏度高、背景低和系统稳定性强等多种优点。
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- 操作简便：无需太多准备，拿到试剂盒即能开展试验。
- 重现性好：实验结果重复性高。
- 适用于HRP显色系统。
| 组分 | 5T | 10T | 保存 |
| 上样缓冲液(5×) | 500μL | 1mL | 室温 |
| 脱脂奶粉 | 8g | 16g | |
| 洗涤液原液(20×) | 30mL | 60mL | |
| 吐温-20 | 500μL | 1mL | |
| 蛋白Marker | 25μL | 50μL | -20℃ |
| HRP标记的二抗(抗兔) | 10μL | 20μL | |
| ECL发光液A | 10mL | 20mL | 2～8℃ |
| ECL发光液B | 30μL | 60μL |
- 电泳缓冲液，转膜缓冲液，印迹膜(PVDF膜需要甲醇活化，NC膜)，一抗。
- 电泳仪，转膜仪，摇床。
- 上样缓冲液(5×)在天气冷的时候很容易有固体析出，请在用之前放在沸水中煮5min，混匀再用。
- 电泳时间可根据目的蛋白分子量调整。如分子量较小(<20kDa)，则溴酚蓝蓝色到达分离胶2/3处即可停止电泳。
如分子量较大(>100kDa)，则溴酚蓝蓝色到底后可继续电泳，以Marker的分子量判断电泳的时间，可等55kDa分子量电泳至分离胶底部。 - 转膜时注意每一层的叠加不要产生气泡，以免影响转膜效果。转膜的时间根据分子量大小调整。转膜的正负极不能放错，胶在负极，膜在正极。转膜一定在冰浴中进行，如果温度过高，胶容易变形影响转膜效果。
- 制备样本：使用上样缓冲液(5×)时，加样体积是样本体积的1/4，即总体积的1/5。
- TBST洗涤液配制：现配现用，先将洗涤液原液(20×)稀释为1×的洗涤液，即19mL蒸馏水/双蒸水/去离子水+1mL洗涤液(20×)。再用10mL 1×的洗涤液+5μL吐温-20
- 封闭液：现配现用，10mL 1×的TBST+0.5g脱脂奶粉配制成5%的封闭液。
- 稀释一抗：现配现用，待封闭后洗涤时准备稀释一抗，按照一抗说明书的建议稀释，稀释液即8mL的封闭液+需要稀释的一抗原液(根据8mL的总体积计算一抗原液的体积)。
- 稀释二抗：现配现用，待一抗孵育后洗涤时准备稀释二抗，即8mL的封闭液+1μL HRP标记的二抗(抗兔)。
- ECL工作液：现配现用，1mL ECL发光液A+3μL ECL发光液B。
- 制样：根据上样量和样本浓度计算样本体积，加入适量的上样缓冲液(5×)，放入沸水中煮15分钟。
- 制胶：根据目的蛋白分子量不同配制不同浓度的分离胶(下层胶)，以下仅供参考。分离胶凝固后再配制5%的浓缩胶(上层胶)。
分离胶浓度 蛋白相对分子量 15% <10kDa 12% 10～30kDa 8% 30～70kDa 6% >70kDa - 电泳：加入电泳缓冲液，起始电压80V，待溴酚蓝蓝色电泳至分离胶，约30min，将电压调至120V待溴酚蓝蓝色到达分离胶底部。
- 转膜：切除浓缩胶，将分离胶放置于转膜缓冲液中，事先准备好与胶大小相同的印迹膜和滤纸。印迹膜如果是PVDF膜需要在甲醇中活化2分钟，再转入转膜缓冲液中浸泡10分钟。滤纸直接放在转膜缓冲液中浸泡10分钟。一般湿转放置顺序：转膜夹黑色面(负极)-海绵垫-滤纸-胶-印迹膜-滤纸-海绵垫-红色面(正极)；半干转：负极-滤纸-胶-印迹膜-滤纸-正极。以6╳8cm的膜为例，湿转恒流一般设置150mA每张膜，可根据分子量的大小调整转膜的时间，分子量大的转膜时间长一些，反之，时间短一些。转膜需在冰浴中进行。
- 封闭：将膜从转膜仪中取出，放入封闭液中，37℃封闭1～2小时。
- 洗涤：弃去封闭液，加入10mL的TBST，置摇床上洗涤10分钟。
- 孵育一抗：弃去洗涤液，加入一抗稀释液，摇床上4℃孵育过夜或37℃孵育1～2小时。
- 洗涤：次日，弃去一抗稀释液，加入10mL的TBST，置摇床上洗涤10分钟，重复2次。
- 孵育二抗：弃去洗涤液，加入二抗稀释液，摇床上室温或37℃孵育40～60分钟。
- 洗涤：弃去二抗稀释液，加入10mL的TBST，置摇床上洗涤10分钟，重复2次。
- ECL曝光：弃去洗涤液，每1cm2膜加入0.05mL的ECL工作液，避光2分钟，直接在机器中观察，或者暗房中经显影液、定影液曝光显色。
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