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NBT即氯化四唑氮蓝为黄色无定形微溶物质，BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸对甲苯胺盐，当二者存在时，在碱性磷酸酶(AP)作用下，过量的BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，剩余的BCIP水解产物会与氧气作用，形成显微镜下可见的紫色沉淀。常用于免疫组化、原位杂交和Western Blot等膜显色或细胞组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。

• 请在使用前按步骤2中的配置比例将溶液A和溶液B充分混合，因混合后的水溶液不稳定，建议现配现用；
  
• 请使用完后将各组分试剂瓶盖旋紧，以防止溶液挥发和与空气中的成分发生化学反应；
  
• 推荐所配试剂的量适合于6×8cm的膜，如果膜较大请适当增加所配试剂的量，以便完全覆盖膜；
  
• 请正确配制Western Blot所需要的试剂及抗体的稀释和冲洗步骤，以保证能够显色和减少杂带的产生；
  
• 显色时间不要太长，否则会产生高背景从而影响实验结果的分析；
  
• 请在实验时戴上一次性手套，溶液A和溶液B有刺激性并对人体有害，请在通风橱中避光操作；
  
• 对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可用中性红染色液染色，以便于观察；
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕；
  
• 本试剂只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等目的，由此产生的后果概不承担责任。

• 在免疫印迹(Western Blot)实验中，先将相应的AP(碱性磷酸酶)标记的二抗覆盖膜后，于37℃振荡器上振荡1~1.5h，再用1X TBST或者1X PBST洗涤膜3～4次，将膜转移到阴暗处；
  
• 显色前先取5X显色缓冲液2mL吸取到一个15mL的干净瓶子中，先用双蒸水将5X显色缓冲液稀释成1倍浓度的液体，再取40μL溶液A和100μL溶液B加入其中并充分混合；
  
• 在阴暗处将10mL的混合液加入膜上，将膜完全覆盖。37℃振荡反应30min即可，这时有紫色的条带出现；
  
• 加入10mL的反应终止液，将膜完全覆盖后振荡1min，用双蒸水冲洗条带3～4次；
  
• 30min内照像记录实验结果，否则所产生的颜色会渐渐褪去。