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BCA法是理想的蛋白质定量方法，在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu⁺。BCA特异性地与Cu⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单并且受干扰物质去垢剂等影响因素小。

• 准确灵敏，线性范围广，BCA试剂的蛋白质测定范围是25～500μg/mL。
  
• 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
  
• 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝，线性关系良好。

• 试剂在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使其溶解，如发现细菌污染则应丢弃。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 该产品中包含配套的BSA标准蛋白溶液，由于BSA易受环境，人为，温度等因素的影响造成失效，建议收到货后将BSA溶液分成多个小管进行冷冻保存，避免反复冻融造成BSA降解失活。
  
• 当溶液A、B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，BCA工作液建议现配现用。
  
• 样品检测后的A562值应在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释或浓缩。
  
• BCA法受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保蛋白中残留的EDTA低于1mM，无EGTA，DTT和β-巯基乙醇需低于1mM。不适用常规BCA法时建议使用百奥莱博的改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1483)或改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1482)或抗干扰型蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1485)。
  
• 当样品中含有儿茶酚氨类等生物氨或者脂、脂蛋白或自由巯基等还原试剂时时，也会使得光吸收值升高，在含铜离子螯合试剂时，可以使的吸光度降低，这时可以用DOC-TCA法沉淀祛除。
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。

• 试剂准备
  
  • 按照以下公式计算所需的BCA工作液总体积。
    
    • BCA工作液总体积=(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积。
  • 根据所需的BCA工作液总体积，定量取溶液A∶溶液B=50∶1，混匀，制成BCA工作液。
    
  • 取一定量的BSA标准溶液，用1×PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na2HPO4·7H2O，1.5mM KH2PO4，pH7.4)溶液稀释为500μg/mL。
    
  • 取16支1.5mL离心管，设置为8个重复管号，按照下表平行操作。
    
  • 将样品用1X PBS做适当倍数的稀释备用。
    

    	0	1	2	3	4	5	6	7
    1×PBS(μL)	300	285	270	240	180	120	60	0
    0.5mg/mL BSA(μL)	0	15	30	60	120	180	240	300
    BSA浓度(μg/mL)	0	25	50	100	200	300	400	500

• 分光光度法
  
  • 取20支1.5mL离心管，分为标准组和样品组。其中16支1.5mL离心管，每个标准品设置1个重复，各管分别加入100μL相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余4支1.5mL离心管，分为2个重复组，重复组离心管编号相同。其中编号不同的两管加入浓度不同的100μL样品稀释液。
    
  • 各管加入1mL BCA工作液，迅速混匀。
    
  • 在37℃水浴中保温30min。
    
  • 冷却至室温后，在分光光度计上测各管的A562值。
    
  • 以标准组各管A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
    
  • 根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。
• 酶标板法
  
  • 选取酶标板上20个孔，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入20μL相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余4孔，分为2个重复组，重复孔编号相同。其中编号不同的两孔加入浓度不同的20μL样品稀释液。
    
  • 各酶标孔加入200μL BCA工作液，迅速混匀。
    
  • 在37℃水浴中保温30min。
    
  • 冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。
    
  • 以标准组各孔A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
    
  • 根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。