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本试剂盒是专为已纯化蛋白质的磷酸化水平定量而设计的，首先用热碱将磷酸化蛋白中的磷酸基团水解下来，再通过染料分子与游离的磷酸分子结合形成染料-磷酸复合物，该染料-磷酸复合物在620nm或650nm处有最大吸收峰，且其吸收值与其浓度成正比，通过分光光度法可对其进行定量分析。本试剂盒具有操作简单快速、定量范围大、线性好和实验方案灵活等特点。考虑到不同用户的实际情况，本试剂盒提供两套实验方案，离心管法每次需200μL样品，酶标板法每次只需50μL样品，可以检测磷酸化蛋白中磷酸基团的范围在7.2～72μM之间。

• 有酶标板法和离心管法两种方法，检测的磷酸基团的范围为7.2～72μM；
  
• 适用于丝氨酸、苏氨酸羟基上磷酸化蛋白磷酸化水平的评估或已知磷酸化蛋白的定量分析；
  
• 整个操作过程只有1个小时左右。

• 检测液请现配现用，配制时请将其混匀，否则易出现颗粒状沉淀，如产生颗粒状沉淀可40℃水浴加热溶解并冷却至室温。
  
• 加入检测液后，若长时间静置可能产生颗粒状沉淀，若是如此，请在进行吸光度检测前请激烈振荡离心管或酶标板，使沉淀溶解，保证实验结果准确。
  
• 样品检测后在A620或A650处的OD值应在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释或浓缩。
  
• 实验过程中使用的玻璃制品若被染色，可用6M HCL清洗后，用无水乙醇浸泡过夜，再用蒸馏水洗净。
  
• 待测样品请用Tris-HCl Buffer或TBS溶解，不能使用磷酸盐缓冲液，否则会产生很大的实验误差。
  
• 酶标板在65℃温浴时间不能超过30min，否则会产生背景增高、显色异常、孔变型、起雾等，影响结果准确性。
  
• 本试剂盒适用于在丝氨酸，苏氨酸羟基上磷酸化的蛋白，而对于在酪氨酸羟基上磷酸化蛋白质不能够检测，而单纯在酪氨酸羟基上磷酸化的蛋白质在自然界中却很少。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 使用后请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气中的物质发生化学反应。
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任。

• 试剂准备
  
  • 用户自行配置适当体积的2.0mol/L NaOH、4.7mol/L HCl和50mmol/L Tris-HCl Buffer（pH7.5）溶液。
    
  • 按照以下公式计算所需的检测液总体积。
    检测液总体积=（标准曲线测定点数+样品数+空白数）×重复次数×每个样品所需的检测液体积
    
  • 根据所需的检测液总体积，取试剂A:试剂B=1:3体积溶液，充分混匀制成检测液。
    
  • 取7支1.5mL离心管，按照下表平行操作。
    

    管号	0	1	2	3	4	5	6
    50mmol/L Tris-HCl Buffer(μL)	500	495	490	480	470	460	450
    磷酸化标准蛋白溶液(μL)	0	5	10	20	30	40	50
    磷酸化标准蛋白溶液浓度(μg/mL)	0	10	20	40	60	80	100

• 离心管法
  
  • 取18支1.5mL离心管，分为标准组和样品组，依次分别标号1~7，8~9，均设置重复管号。样品实验前可做适当稀释或浓缩，样品可取2个不同浓度梯度，标号为8~9。向标准组中每管分别加入200μL各浓度的磷酸化标准蛋白溶液，向样品组中每管分别加入200μL磷酸化蛋白样品。
    
  • 向每管中加入200μL的2.0mol/L NaOH混匀，65℃水浴孵育30min。
    
  • 待溶液冷却至室温后，向每管中加入200μL的4.7mol/L HCl涡旋混匀。
    
  • 再向每管加入200μL检测液涡旋混匀，室温静置30min，期间振荡混匀1～2次，进行吸光度值检测前再混匀1次。
    
  • 以0号管作为空白对照，在分光光度计上测每管在A620处的OD值。
    
  • 以标准组每管A620处的OD值的平均值为纵坐标（Y），对应的磷酸化标准蛋白终浓度为横坐标（X），在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线，通过样品组每管A620处的OD值（Y）的平均值计算待测样品中磷酸化蛋白浓度值（X）。
    注意：需要选择合适范围的A620处的平均值计算样品磷酸化的浓度值，如果样品A620处的平均值不在检测线性范围内，需要对样品做适当稀释或浓缩。
• 酶标仪法
  
  • 选取18个酶标孔，分为标准组和样品组，依次分别标号1~7，8~9，均设置重复孔号。样品实验前可做适当稀释或浓缩，
    样品可取2个不同浓度梯度，标号为8~9。向标准组每孔中分别加入50μL各浓度的磷酸化标准蛋白溶液，向样品组每孔
    中分别加入50μL磷酸化蛋白样品。
    
  • 再向每孔中加入50μL的2.0mol/L NaOH混匀，65℃水浴孵育30min。
    
  • 待溶液冷却至室温后，向每孔加入50μL的4.7mol/L HCl涡旋混匀。
    
  • 再向每孔加入50μL检测液涡旋混匀，室温静置30min，期间振荡混匀1～2次，进行吸光度值检测前再混匀1次。
    
  • 以0号孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔在A620处的OD值。
    
  • 以标准组各孔在A620处的OD值的平均值为纵坐标（Y），对应的磷酸化标准蛋白终浓度为横坐标（X），在酶标仪上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线，通过样品组每孔在A620处的OD值（Y）的平均值计算待测样品中磷酸化蛋白浓度值（X）。
• 磷酸化水平的计算
  

  N(蛋白磷酸化水平%)＝	待测样品磷酸化蛋白浓度值(X)×磷酸化标准蛋白的磷酸化水平(2.24%)×待测磷酸化蛋白的分子量(A)
  	待测样品蛋白浓度(B)×磷的原子量(31)

  
  N表示每摩尔待测磷酸化蛋白质所含的磷的摩尔数百分比；
  A表示样品的蛋白分子量（g/mol）；
  B表示样品的蛋白浓度（μg/mL）；
  X表示样品中磷酸化蛋白浓度值（μg/mL）；
  注：磷酸化标准蛋白的磷酸化水平为2.24%。
  相关搜索：蛋白磷酸化水平检测试剂盒，Phosphoprotein Phosphate Estimation Kit