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微量BCA蛋白定量检测法是基于Bicinchoninic Acid研制而成，其检测原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与Cu²⁺离子生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu⁺，BCA可敏感的特异的与Cu⁺结合，形成稳定的有色化合物，在562nm处有高的吸光度，颜色的深浅与蛋白质浓度呈正比，可根据吸光度值的大小来测定蛋白质的含量，MicroBCA Protein Assay Kit在10～250μg/mL浓度范围内有较好的线性关系，其最小检出量为5μg/mL左右。

• 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存。
  
• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 待测蛋白和蛋白标准加入Micro BCA工作液后，如果发现检测效果不佳，可以60℃水浴120min，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随温度升高而加快；如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。
  
• BCA法检测中样本中不应含有EGTA，否则影响检测结果。
  
• 因BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，建议每次测定时都做标准曲线，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的最小检测体积。应按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大；使用分光光度计测定蛋白浓度时，可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但是切勿过热，否则易失效。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验结果。

• 取1mL蛋白标准配制液完全加入到含有20mg的蛋白标准(BSA)中，充分溶解，后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。
  
• 取适量的蛋白标准溶液(20mg/mL)，稀释至终浓度为200μg/mL或所需浓度；如取10μL蛋白标准20mg/mL，加入990μL稀释液中，充分混匀，即成蛋白标准溶液(200μg/mL)。
  特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，例如待测蛋白溶解于蔗糖溶液中，亦取20mg/mL蛋白标准溶解于蔗糖溶液中；一般也可以用0.9%NaCl或PBS作为溶解BSA的稀释液，稀释后的200μg/mL蛋白标准溶液也应-20℃长期保存。
  
• 根据样品数量，按试剂(A):试剂(B):试剂(C)=26:25:1的比例配制Micro BCA工作液，充分混匀(注意：Micro BCA工作液应为浅绿色或苹果绿色，如变为紫色或其他颜色应弃用)。例如取2.6mL BCA试剂A、2.5mL BCA试剂B和0.1mL BCA试剂C，配制成5.2mL Micro BCA工作液，Micro BCA工作液室温24小时内稳定。
  
• 稀释系列标准品：将200μg/mL蛋白标准溶液和稀释液按下边一次加入到96孔板或EP管中，即得相应标准梯度。
  

  成分(μL)	0	1	2	3	4	5	6	7
  蛋白标准(200μg/mL)	0	1	2	4	8	12	16	20
  稀释液	20	19	18	16	12	8	4	0
  蛋白浓度(μg/ml)	0	10	20	40	80	120	160	200

• 加20μL待测蛋白到96孔板或EP管中，如果样本不足20μL，用稀释液补足至20μL。
  
• 各孔或管加入200μL配制好的Micro BCA工作液，60℃孵育60min。
  
• 酶标仪或分光光度计测定562nm波长处吸光度(如无562nm，540～595nm之间的波长也可)，各孔或管吸光度减去”0”号孔的吸光度，以求得的差值为纵坐标，以标准孔或管中的蛋白浓度(μg/ml)为横坐标，得出标准曲线及回归方程，根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。