产品货号:
GL1484
中文名称:
BCA蛋白定量试剂盒
英文名称:
BCA Protein Assay Kit
产品规格:
250T|500T|2500T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于微量蛋白质浓度的测定,其最小检出量为25μg/mL,在50~2000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。
BCA法与传统方法相比,操作更简单、试剂及其形成的颜色复合物更稳定、灵敏度更高。BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好,不受大部分样本中其他成分的影响,对于5%以内的去垢剂如SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween80、NP-40具有很好的兼容性,但易受螯合剂、还原剂等的影响,在测定蛋白浓度前应尽量使样本满足如下要求:EDTA浓度≤10mM、DTT浓度≤1mM、2-ME≤0.01%、无EGTA。
BCA法测蛋白的原理是在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562nm处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。
组分 | 250T | 500T | 2500T |
BCA试剂A | 50mL | 100mL | 500mL |
BCA试剂B | 1.5mL | 3mL | 15mL |
蛋白标准(BSA) | 20mg | 20mg | 20mg |
蛋白标准配制液 | 5mL | 10mL | 10mL |
保存:室温,有效期1年。
- 蒸馏水、生理盐水或PBS
- 酶标仪或分光光度计、EP管、96孔板或比色皿、恒温箱或水浴锅
- 蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后,即获得蛋白标准原液(即20mg/mL的蛋白标准),该原液中含有防腐剂,不影响后续检测,该蛋白标准原液-20℃长期保存。
- 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中,否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致,有可能导致测定不准确。
- 如果检测效果不佳,可以室温放置2h或60℃放置30min,颜色会随着时间的延长不断加深,显色反应也会随温度升高而加快;如果浓度较低,可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
- 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加,吸光度或颜色没有明显变化,可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。
- 如检测样本中含有较多螯合剂、还原剂等影响因素时可考虑Bradford法测定。
- 因BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,建议每次测定时都作标准曲线,且显色反应的速度和温度有关,所以除非精确控制显色反应的时间和温度,否则每次都做标准曲线。
- 如果没有酶标仪也可以用普通的分光光度计测定,但应考虑比色皿的最小测定体积,按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于最小检测体积,样品和标准品的用量亦相应按比例放大;使用分光光度计测定蛋白浓度时,可以测定的样品数量会显著减少。
- 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热,但切勿过热,否则易失效。
- 试剂开封后请尽快使用,以防影响后续实验效果。
- 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热,但是切勿过热。室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。
- 取1mL蛋白标准配制液加入到含有20mg的蛋白标准(BSA)中,充分溶解后配制成20mg/mL的蛋白标准溶液,配制后可立即使用,配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。
- 取适量的20mg/mL蛋白标准溶液,稀释至终浓度为500μg/mL,如取25μL蛋白标准(20mg/mL),加入975μL稀释液,充分混匀即配制成500μg/mL蛋白标准溶液。
- 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中,蛋白标准也宜溶解于同样的溶液中,一般可用0.9%NaCl或PBS作为BSA的稀释液,稀释后的500μg/mL蛋白标准溶液也应-20℃长期保存。
- 根据样品数量,取试剂A、B按50∶1的比例配制BCA工作液,即取50份BCA试剂A和1份BCA试剂B,充分混匀,即获得BCA工作液();例如取5mL BCA试剂A和0.1mL BCA试剂B,配制成5.1mL BCA工作液,BCA工作液室温24小时内稳定。
- 正常BCA工作液应为苹果绿或墨绿色,如变为紫色或其他颜色应弃用。
- 将500μg/mL蛋白标准溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板或EP管中,加稀释液补足至20μL,其蛋白标准浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL。
- 加20μL待测蛋白到96孔板或EP管中,如果样本不足20μL,用稀释液补足至20μL。
- 如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液不同,应在待测蛋白中加入20μL稀释液;如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液相同,无需在待测蛋白孔中加入20μL稀释液,以减少不同溶液的差异。
- 向各孔或EP管加入200μL配制好的BCA工作液,迅速混匀,37℃孵育30~60min。
- 冷却至室温,立即用酶标仪或分光光度计测定562nm波长处吸光度(如无562nm,540~595nm之间的波长也可),各孔或EP管吸光度减去蛋白浓度为0μg/mL的标准管的吸光度,以求得的差值为纵坐标:以标准孔或EP管中蛋白浓度(μg/ml)为横坐标,得出标准曲线及回归方程,根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。
标准曲线制作:
在室温条件下按说明书操作,对系列标准用酶标仪测定570nm时的吸光度,其数值及标准曲线如下(仅供参考):
蛋白标准(μg/mL) | 0 | 25 | 50 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 |
吸光度 | 0.205 | 0.211 | 0.266 | 0.364 | 0.547 | 0.72 | 0.87 | 1.009 |
- 对于10~50μg/mL范围内的蛋白样品,要充分考虑如EDTA、2-ME、DTT等干扰因素,其检测结果波动较大,标准品亦有波动,请注意小心精细操作,建议采购微量BCA蛋白定量试剂盒(货号:GL2337)。
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