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MBP标签蛋白纯化试剂盒图片
产品货号:
BTN130871
中文名称:
MBP标签蛋白纯化试剂盒
英文名称:
Maltose Binding Protein Purification Kit
产品规格:
20T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒。


MBP(麦芽糖结合蛋白,Maltose Binding Protein)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化,结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高,易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。




  • 一站式套装,含所需直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱,操作非常方便。
  • 提供2mL的直链淀粉-琼脂糖介质,其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质。
  • 采用麦芽糖温和洗脱,无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
  • 本试剂盒足够20次制备,但介质可以反复使用更多次(需要复活)。



成分规格
直链淀粉-琼脂糖介质2mL
1M Tris-HCl(pH7.4)25mL
0.1M EDTA溶液25mL
2M NaCl溶液50mL
蔗糖20g
PMSF(10mg/mL)1mL
0.1mM MgCl2溶液50mL
0.1M麦芽糖溶液25mL
层析柱(6mL)1支

保存:RT,其中介质需4℃保存,PMSF需要-20℃保存,有效期一年。


去离子水、20%乙醇、0.22μm或0.45μm滤膜、自备透析袋(规格需小于MBP麦芽糖结合蛋白分子量)。


  • 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据MBP蛋白产量决定,其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质,请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
  • 用5倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积,下同)自备去离子水洗柱,共3次。
  • 用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱,进行平衡,使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下(以10mL为例):
    成分用量在结合缓冲液中的浓度
    1M Tris-HCl(pH7.4)0.2mL20mM
    0.1M EDTA溶液0.1mL1mM
    2M NaCl溶液1mL200mM
    自备去离子水8.7mL-
  • 4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液,弃上清,将细胞沉淀(约100mg)悬于2mL冰冷的现配的细胞洗涤液中,4℃ 5000g离心15分钟收集细胞沉淀后,再次悬于2mL冰冷的细胞洗涤液中。(最好用不加诱导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以10mL为例):
    成分用量在细胞洗涤液中的浓度
    1M Tris-HCl(pH7.4)0.1mL10mM
    2M NaCl溶液0.15mL30mM
    自备去离子水9.75mL-
  • 制备细胞裂解物:
    • 如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
      • 超声破碎细胞,功率30 W,保持细胞低温(0℃),直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索,但裂解物必须不粘稠,否则会堵塞层析柱。)
      • 为使溶液澄清,向上述细胞洗涤液中加入35μL PMSF(10mg/mL)。
      • 4℃下13000~15000g离心30分钟,以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱,收集上清样品,留样做SDS-PAGE电泳对照,其余样品用于纯化MBP融合蛋白,直接进入第6步。
    • 如果所用载体带MBP信号肽序列(如pMAL-p2)
      • 4℃ 5000g离心15分钟收集细胞,沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例):
        成分用量在细胞裂解液中的浓度
        1M Tris-HCl(pH7.4)0.3mL30mM
        0.1M EDTA溶液0.01mL0.1mM
        蔗糖2g20%(m/V)
        自备去离子水加水到10mL-
      • 加入25μL PMSF(10mg/mL),室温搅动15分钟,于4℃ 13000~15000g离心10分钟收集细胞。
      • 旋动细胞沉淀,加入2mL冰冷的0.1mM MgCl2溶液,4℃搅动10分钟。
      • 休克细胞4℃ 13000~15000g离心10分钟,在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)至pH为7.4。
        • 10mM Tris-HCl(pH7.4)可由1M Tris-HCl,pH7.4稀释100倍配制而成。
      • 上清用0.22μm或0.45μm滤膜过滤,滤液用100倍体积的10mM Tris-HCl(pH7.4),使用自备透析袋4℃透析。
      • 收集透析后样品,留样做SDS-PAGE电泳对照,其余样品用于纯化MBP融合蛋白,直接进入第6步。
  • 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接触,以提高目的蛋白的回收率),收集流出液。
  • 用10~15倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
  • 使用5~10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白,收集洗脱液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以10mL为例):
    成分用量在麦芽糖洗脱液中的浓度
    1M Tris-HCl(pH7.4)0.2mL20mM
    0.1M EDTA溶液0.1mL1mM
    0.1M麦芽糖溶液1mL10mM
    自备去离子水8.7mL-
  • 将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
  • 填料介质清洗:依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质,最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4℃保存,防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
  • 蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤,所用试剂需自备):用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
    • 加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀,室温下振荡2~16小时。
    • 4℃以500g离心5分钟,上清小心转移到新离心管中。
    • 用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。



问题原因分析推荐解决方案
柱子反压过高填料被堵塞按照第10步进行介质清洗。
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤,或者离心去除。
目的蛋白没有吸附目的蛋白未表达确保目的蛋白表达
样品或缓冲液中存在一些干扰因素如非离子去污剂样品透析或用结合缓冲液稀释
细胞产生大量的淀粉酶影响结合力培养基中添加葡萄糖,抑制淀粉酶的表达
融合蛋白使麦芽糖结合位点阻塞或扭曲,影响了目的蛋白的结合力更换载体
柱子结合时间太短将样品与介质振荡孵育4度2小时或更长时间
洗脱样品较杂目的蛋白降解加一些蛋白酶抑制剂,如PMSF、EDTA等
平衡/洗杂不充分增加平衡液体积,确保介质充分平衡/洗杂,如介质太脏按照第10步进行树脂清洗

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