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MBP（麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。

• 一站式套装，含所需直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
  
• 提供2mL的直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质。
  
• 采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
  
• 本试剂盒足够20次制备，但介质可以反复使用更多次（需要复活）。

• 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
  
• 用5倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积，下同)自备去离子水洗柱，共3次。
  
• 用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下(以10mL为例)：
  

  成分	用量	在结合缓冲液中的浓度
  1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
  0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
  2M NaCl溶液	1mL	200mM
  自备去离子水	8.7mL	-

• 4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀(约100mg)悬于2mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2mL冰冷的细胞洗涤液中。(最好用不加诱导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以10mL为例)：
  

  成分	用量	在细胞洗涤液中的浓度
  1M Tris-HCl(pH7.4)	0.1mL	10mM
  2M NaCl溶液	0.15mL	30mM
  自备去离子水	9.75mL	-

• 制备细胞裂解物：
  
  • 如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
    
    • 超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温(0℃)，直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。)
      
    • 为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35μL PMSF(10mg/mL)。
      
    • 4℃下13000～15000g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
  • 如果所用载体带MBP信号肽序列(如pMAL-p2)
    
    • 4℃ 5000g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例)：
      

      成分	用量	在细胞裂解液中的浓度
      1M Tris-HCl(pH7.4)	0.3mL	30mM
      0.1M EDTA溶液	0.01mL	0.1mM
      蔗糖	2g	20%(m/V)
      自备去离子水	加水到10mL	-

    • 加入25μL PMSF(10mg/mL)，室温搅动15分钟，于4℃ 13000～15000g离心10分钟收集细胞。
      
    • 旋动细胞沉淀，加入2mL冰冷的0.1mM MgCl₂溶液，4℃搅动10分钟。
      
    • 休克细胞4℃ 13000～15000g离心10分钟，在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)至pH为7.4。
      
      • 10mM Tris-HCl(pH7.4)可由1M Tris-HCl，pH7.4稀释100倍配制而成。
    • 上清用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10mM Tris-HCl(pH7.4)，使用自备透析袋4℃透析。
      
    • 收集透析后样品，留样做SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
• 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。
  
• 用10～15倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
  
• 使用5～10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以10mL为例)：
  

  成分	用量	在麦芽糖洗脱液中的浓度
  1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
  0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
  0.1M麦芽糖溶液	1mL	10mM
  自备去离子水	8.7mL	-

• 将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
  
• 填料介质清洗：依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
  
• 蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤，所用试剂需自备)：用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
  
  • 加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2～16小时。
    
  • 4℃以500g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
    
  • 用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。