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BCA法是在世界上常用的蛋白浓度检测方法之一BCA法基础上改进而成。众所周知，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

• 步骤简单，45分钟内完成测定，比经典Lowry法快4倍而且更加方便。
  
• 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/mL，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1～20μL。
  
• BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。
  
• 在20～2000μg/mL浓度范围内有良好的线性关系。
  
• 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

• 蛋白标准请在全部溶解后先混匀，再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。标准品曲线配制时，如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线相关系数减小，可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制，或者使用精确度高的加样枪。
  
• Solution A和Solution B混合成工作液时可能会有浑浊，但充分振荡混匀后就会消失，成为淡绿色的透明溶液。
  
• 需酶标仪一台，测定波长为540～590nm之间，562nm最佳；需96孔板。如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但是测定蛋白浓度时，需根据测定吸光度的杯子的体积，按比例调整A液，B液和样品的体积。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• BCA蛋白定量试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保无EGTA，EDTA低于10mM，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于1mM。不适用BCA法时建议使用Bradford法蛋白定量试剂盒。还可以考虑用超纯水稀释，透析/除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。
  
• 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但是切勿过热。
  
• 如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，请试用Bradford法蛋白定量试剂盒。

• 使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
  
• 完全溶解BSA蛋白标准液(5mg/mL)，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。蛋白样品在什么溶液中，蛋白标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释蛋白标准品。
  
• 步骤3：将稀释后BSA蛋白标准液(0.5mg/mL)按0、1、2、4、8、12、16、20μL分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μL。
  
• 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。
  
• 各孔加入200μL BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀（注意不要弄出气泡影响读数）37℃放置30～60分钟。
  
  • 也可以根据需要在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
• 冷却到室温后，用酶标仪测定A562，或540～590nm之间的其它波长的吸光度。
  
• 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。