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本制品是专门设计的敏感性加强型原位杂交检测试剂盒。具有敏感性特高，操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶检测，一种为碱性磷酸酶检测系统。用于mRNA的杂交。本试剂盒仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针，不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针。如果使用cDNA探针，应在杂交之前变性探针。

所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具，其作用是免疫组化所无法代替的。

• 3%柠檬酸：100mL蒸馏水中加3g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，pH2.0左右。
  
• 2×SSC：1L蒸馏水中加17.6g NaCl，8.8g柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O)。
  
• 0.5×SSC：300mL蒸馏水加100mL 2×SSC即可。
  
• 0.2×SSC：270mL蒸馏水加30mL 2×SSC即可。
  
• 0.5M PBS：1L蒸馏水加30g NaCl，6g Na2HPO4·12H2O，0.4g NaH2PO4·2H2O，pH7.2～7.6。
  
• 10mM TBS：1L双蒸水中加入8.5g NaCl，1.2g Tris，pH7.2～7.6。

• 原位杂交实验的样本固定很重要。首先是固定液中需加入0.1%的DEPC，以抑制RNA酶对核酸的分解作用。其次，固定时间建议不要超过6小时（细胞片15分钟即可），过度固定会造成背景加深、阳性减弱、定位不准等不利影响。
  
• 实验中预杂交和杂交温度较高，需在湿盒中加足量的水以保证样本始终处于湿润状态，切勿干片。
  
• 如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
  
• 当其它非特异性染色很明显时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2～5倍。

• 石蜡片及冰冻片染色步骤：
  
  • 石蜡切片，常规脱蜡至水。冰冻片无需此操作，从第2步开始。
    
  • 暴露mRNA片段：滴加新鲜配制的胃蛋白酶，室温孵育消化2～10分钟。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
    
    • 胃蛋白酶∶蛋白酶稀释液=1∶10，现配现用。
      
    • 新鲜样本可以考虑不消化，越陈旧的样本消化时间越长。
  • 预杂交：按每张切片20μL加预杂交液。37℃孵育2～4小时。吸取多余液体，不洗。孵育期间一定要保证组织为湿润状态，不得干片（湿盒内加足量的水）
    
  • 杂交：用探针稀释液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针（稀释后的杂交液浓度一般为0.5～2μg/mL）。每张切片加20μL稀释好的杂交液，40℃杂交过夜。
    
    • 需保证覆盖组织，若组织过大，可适量增加杂交液的量。
      
    • 若此温度阳性结果不明显，可提高杂交温度至60℃，期间需保证组织不得干片。
  • 杂交后洗涤：
    ① 2×SSC洗涤5分钟×2次；
    ② 0.5×SSC洗涤15分钟×1次；
    ③ 0.2×SSC洗涤15分钟×1次。
    ④ 必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
    
  • 封闭：滴加封闭液，37℃孵育30min。甩去多余液体，不洗。
    
  • 滴加碱性磷酸酶标记鼠抗地高辛抗体：用10mM TBS按1∶200稀释，37℃孵育60分钟，或室温2小时，10mM TBS洗5～10分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
    
  • 显色：BCIP/NBT显色液A∶显色液B∶蒸馏水按照1∶1∶20比例配制，现配现用，混匀后加至切片。镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。
    
    • 1mL显色液配制方法：1mL蒸馏水+50μL显色液A+50μL显色液B。
      
    • 该显色液显色时间较长，若无背景出现可长时间显色，直至结果满意为止。
  • 核固红轻度复染：水洗，干燥后水溶性封片剂。
    
  • 显微镜观察。
• 细胞片的染色步骤：
  
  • 取出细胞爬片，TBS缓冲液浸泡5min。
    
  • 破膜。使用0.25% Triton X-100处理细胞15min，TBS缓冲液洗涤，5min×3次。
    
  • 其余步骤和石蜡切片2～10步相同。