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所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和DIG-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测一般用碱性磷酸酶系统，BC1P/NBT显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。

• 标记属高效标记反应。以1μg DNA探针为例，1小时反应即可产生0.8μg标记探针，20小时可产生2μg左右的标记探针。
  
• 试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11-dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。
  
• 标记反应适于下述对象：
  
  • DNA从10ng～3μg。
    
  • 不等的DNA长度100bp～10kb。
    
  • 线形排列或呈高度卷曲之DNA。
    
  • 低融点琼脂中的DNA。
• 检测系统抗体为抗地高辛单抗，标记碱性磷酸酶。效价1∶5000（膜上杂交）或1∶500（原位杂交）。
  
• 显色剂为BCIP/NBT，两种成分混合后保存于67%DMF中，非常稳定。用时1∶50稀释。
  
• 试剂盒敏感性达到0.1pg，足够检测出1μg基因组DNA中的单个基因。
  
• 除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。

组分	规格
Anti-DIG-AP Conjugate	100μL
BCIP/NBT Stock Solution	1mL
Blocking Reagent	5g

保存：-20℃，有效期1年。


核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程，步骤多耗时长，影响因素多。要想获得理想结果，每一步都应严格操作。下面几个问题尤其应予注意：

• 无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应在滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头。使用干净平皿：每次用前必须严格清洗。
  
• 膜的操作：操作膜时戴无尘的手套；只用无齿镊操作膜的边缘。
  
• 原位杂交：每步反应均应加盖硅化的盖玻片。

一、随机引物标记操作程序如下：

• 用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μL。
  
• DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
  
• 加4μL DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000rpm×5分钟。
  
• 置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
  
• 加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。
  可根据下表估计标记产量：
  

  DNA模板量(ng)	标记一小时(ng)	标记二十小时(ng)
  10	45	600
  30	130	1050
  100	270	1500
  300	450	2000
  1000	850	2300
  3000	1350	2650

二、核酸探针膜上杂交原理和操作

• 杂交总原则
  脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。
  
• 杂交膜的选择
  杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸5～10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
  
• 探针浓度
  探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取5μL标记反应液加1mL探针稀释液，混匀。取0.5mL等倍释后，再取0.5mL继续等倍稀释。假设20μL标记反应液中含1μg标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：
  200ng/mL、100nt/ml、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL。
  
• 预杂交和杂交液
  预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：
  ① Standard buffer：5×SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
  ② Standard buffer + 50% formamide：50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02% (w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
  ③ High SDS buffer(Church buffer)：7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
  
• Southern Blotting
  DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。Southern印迹杂交包括两个主要步骤，把电泳分级的DNA转移到固相支持膜上，与标记的DNA探针杂交，具体操作步骤如下。
  
  • Southern转移
    首先将DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。
    
    • 试剂准备：
      
      • 0.25M HCl
        
      • 变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCl
        
      • 中和液：0.5M Tris-HCl,pH7.4,3M NaCl
        
      • 20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl。
        
      • 2×SSC：0.03M柠檬酸钠，0.3M NaCl。
    • 操作程序：
      
      • 将胶浸入0.25M HCl中10分钟。HCl处理的作用主要是通过去嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。
        
      • 进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20～30分钟。
        
      • 把胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。
        
      • 蒸馏水漂洗凝胶2次。
        
      • 把胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。
        
      • 在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用2×SSC浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。
        
      • 准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。
        
      • 依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500～1000g)。
        注意：要检查pH值，用硝纤膜时pH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA难以被吸到硝酸纤维膜上。
        
      • 于室温转移12～20小时。
        
      • 取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。
        
      • 固定：可选择下述方法之一进行DNA固定
        
        • 紫外线固定：使用长波紫外线照射10～20分钟，简单漂洗后干燥备用。
          
        • 尼龙膜置+120℃烘烤30分钟。
          
        • 硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤2～2.5小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，亦可在普通烤箱中65～70℃烘烤3～4小时，也能达到固定目的。固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。
    • 注意事项：
      
      • 转移液的盐浓度对转移具有一定影响。一般选择20×SSC快速转移。10×SSC转移速度较慢，对于高分子量DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。
        
      • 转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。
        
      • 硝酸纤维膜对于0.5kb以下的小分子DNA结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。
  • Southern印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5～25ng/mL，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。
    
    • 试剂准备：
      
      • Standard buffer
        
      • Standard buffer + 50% formamide
        
      • High SDS buffer
        
      • Wash Solution I：2×SSC,0.1%SDS
        
      • Wash Solution Ⅱ：0.5×SSC,0.1%SDS
    • 操作程序：
      
      • 将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留2～4mm空隙。灌注杂交液的一边留1cm空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。
        
      • 根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4～20小时：Standard buffer:预杂交温度65～68℃，Standard buffer+50% formamide:37～42℃，High SDS buffer:37～42℃
        
      • 使用双链DNA探针时，沸水浴10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度5～25ng/mL。按每100cm2膜加入至少3.5mL配制杂交液。
        
      • 使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16～20小时。
        
      • 杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68℃变性10分钟即可。
        
      • 取出杂交膜，用Wash Solution I洗5分钟×3次。
        
      • 保温冲洗：用Wash SolutionⅡ于68℃冲洗15分钟×2次。
• DNA Dot Blotting
  此检测方法用于快速定性筛选DNA。样品可以是纯化DNA，也可以是细胞碎片PCR扩的DNA。预杂交和
  杂交方法与Southern基本一致，不同的仅是样品的处理不同。
  
  • 试剂准备：
    DNA dilution buffer∶10mM Tris-HCl；1mM EDTA,pH8.0；50μg/mL herring Sperm DNA
    
  • 操作程序：
    
    • 将样本DNA稀释成不同浓度。
      
    • 将样本DNA于+95℃水浴10分钟，迅速插入冰中。
      
    • 取1μL点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。
      
    • 用紫外线照射固定或+120℃烘烤30分钟固定。
      
    • 其后杂交步骤Southern相同。
• BCIP/NBT显色检测法
  
  • 试剂准备：
    
    • Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体。
      
    • BC1P/NBT储备液
      
    • 冲洗液：0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.4。
      
    • 封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl。
      
    • 显色缓冲液：0.1M Tris-HCl,0.1M,NaCl,pH9.5。
      
    • TE缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0。
  • 操作程序：
    
    • 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。
      
    • 用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。
      
    • 用封闭液(d)按1∶2500～5000比例稀释Anti-DIG-AP，例如2μL Anti-DIG-AP加至5～10mL封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液+4℃可稳定12小时左右。
      
    • 加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。
      
    • 用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次100mL。
      
    • 按1∶50配制底物显色液：例如100μL“BCIP/NBT储备液”(b)加至5mL显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。
      
    • 显色缓冲液20mL平衡2分钟后倾掉。
      
    • 加10mL底物显色液(100cm2)。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免振动，以免出现显色带的移位。
      
    • 当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以中止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液(f)，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择是让膜干燥，颜色消退。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

三、原位杂交
所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在DNA、mRNA水平的表达。原位杂交技术最早Pardue and Gall和John etal。分别在1969年发现。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。

• 染色体原位杂交的一般技术
  
  • 玻片准备
    为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨酸或APES处理玻片。
    
  • 固定
    为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用4%甲醛或Bouin's固定液固定30分钟。应予注意的是，DNA和RNA虽然不和各种交联剂反应。但包围DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。
    
  • 玻片上材料的预处理
    
    • 内源性酶的灭活如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。
      
    • RNA酶的处理：DNA-DNA杂交时需要处理内源性RNA。内源性RNA的存在，会由于DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RNase(100μg/mL)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM NaCl,15mM Sodium Citrate,pH7.4)
      
    • HCl处理：用200mM HCl处理20～30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。
      
    • 去垢剂处理：在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,Sodium dodecyl Sulfate等，同样有助于原位杂交技术。
      
    • 蛋白酶消化：蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HCl,2mM CaC12，pH7.4,37℃ 15～30分钟。蛋白酶K浓度依不同对象来确定。例如对染色体和核的分离部分，可以用1μg/mL蛋白酶K。
  • 探针和靶基因的变性
    对染色体DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到80℃，2分钟后取出冷却至37℃。如果是组织切片，变性时间应达到80℃ 10分钟。
    
  • 杂交后的冲洗
    标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。
    
  • 免疫细胞化学
    免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HCl缓冲液含“Blocking Reagent”。此外0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。在标准的免疫反应程序中，先对染色体、细胞和组织进行封闭，然后用酶标抗体37℃反应30分钟(或室温1～2小时)。此后用含Tween 20的缓冲液进行三次冲洗每次5～10分钟。免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用DAB作显色剂。后者用BCIP/NBT作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。
    
  • 影响原位杂交的主要因素
    
    • 探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：
      
    • 探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的最高探针浓度。
      
    • 硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。
      
    • 碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。
      
    • 冲洗条件
  • 杂交标准条件
    适于DNA探针＞100bp
    50%去离子甲酰胺，2×SSC，50mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH7.0)，1mM EDTA，载体DNA：鲑角精子DNA 100～250ng/μL。
    任选组合：
    1×Denhardt's
    dextran sulfate,1～10%
    温度：37～42℃
    杂交时间：5～16小时
  
  
  
• 组织切片的原位杂交
  目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤：
  ① 靶DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。
  ② DNA的变性和杂交。
  ③ 杂交的分子的冲洗和检测。
  
  • 探针的准备
    
  • 玻片的处理
    
    • 去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗
      
    • 干燥之后，浸入丙酮中3分钟。
      
    • 玻片移入1∶50丙酮稀释的APES溶液中，浸泡5分钟。
      
    • 玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多聚赖氨酸”处理。
  • 组织切片的准备
    
    • 组织用常规4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。
      
    • 常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。
      
    • 切片处理：先置60℃烘片30分钟。二甲苯脱蜡，逐级酒精至水清洗。
      
    • 临用前配制蛋白酶K溶液：
      储备液：Proteinase K,10mg/mL H2O，小量分袋-20℃保存。将储备液用TES稀释成100μg/mL。（TES=5mM TrisHCl,10mM EDTA,10mM NaCl,pH7.4）
      
    • 每张切片用Proteinase k 20～30μL 37℃消化15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。
  • 杂交
    
    • 蛋白K消化后，去除盖玻片。用4%甲醛4℃固定5分钟。
      
    • 蒸馏水洗5分钟。
      
    • 让切片上水分滴下去，并在室温干燥5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切片完全干燥。
      
    • 每张切片加5～10μL探针(大切片需相应增加)。
      
    • 设立严格的对照组，每张切片加5～10μL不加探针的杂交液。
      
    • 切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95℃变性6分钟。
      
    • 把玻片放到冰上1分钟。
      
    • 切片置温盒，42℃杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。
  • 冲洗
    去掉盖玻片，按下述程序冲洗，2×SSC洗5分钟×2次(室温),0.1×SSC洗10分钟(42℃)
    
  • 杂交分子的检测---BCIP/NBT
    
    • 切片置于0.1M TBS缓冲液中，pH7.4。
      
    • 每张切片加20～40μL封闭液：0.5% Blocking Reagont/0.1M TBS。
      
    • 室温反应15分钟。
      
    • 用封闭液1∶500稀释Anti-DIG-AP；(临用之前才配，配好后立即加至切片)
      
    • 每张切片加20～50μL稀释试剂，湿盒室温反应1～2小时。
      
    • 用0.1M TBS洗10分钟×3次
      
    • 用0.2M Tris-HCl,10mM MgC12,pH9.2平衡5分钟。
      
    • 配显色剂：将BCIP/NBT储备液用上述缓冲液1∶50稀释。每张切片加20μL，置黑暗处显色。显色快时，一般30～60分钟。信号弱时显色过夜。
• 细胞的原位杂交
  下面的程序是用标记DNA探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。
  
  • 细胞准备，固定和增加通透性
    注意：所有溶液都必须用RNase抑制剂处理。
    
    • 玻片用多聚赖氨酸处理。直接用5% CO₂在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红Dulbecco's基础培养基。
      
    • 37℃PBS清洗细胞。然后用下述固定液室温固定30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0.9% NaCl。
      
    • 室温PBS清洗固定细胞，用70%乙醇储存于4℃
      
    • 杂交前用下述方法脱水：70%，90%和100%乙醇；10%二甲苯；然后再用100%，90%，70%乙醇，最后PBS洗二次。
      
    • 用胃蛋白酶消化细胞：0.1%Pepsin/0.1N HCl，37℃5～10分钟。
      
    • PBS洗5分钟后，1%甲醛固定10分钟。PBS洗。
  • 杂交
    
    • 地高辛标记探针。
      
    • 杂交液配制：60%去离心甲酰胺，0.3M NaCl，30mM柠檬酸三钠，10mM EDTA，25mM Na2HPO4(pH7.4)，5%硫酸萄聚糖，250ng/μl鲑角精子DNA。
      
    • 于80℃10分钟变性标记探针，然后加至上述杂交液中，浓度为5ng/μL。
      
    • 加10μL杂交液至玻片上，并盖上盖玻片。注意：也可选择原位变性步骤，这样可增加RNA和探针的接触性。
      
    • 37℃杂交16小时。
  • 洗涤
    杂交后去掉盖玻片，于下述溶液中充分洗涤：60%甲酰胺，300mM NaCl，30mM柠檬酸钠。室温洗三次，37℃洗一次。然后PBS洗5分钟。
    
  • 免疫检测
    
    • 用下述缓冲液作非特异性的封闭：0.5% Blocking Reagent/0.1M TBS，加盖玻片。室温15分钟。
      
    • 用封闭液1∶500稀释Anti-DIG-AP(临用之前才配，配好后立即加至切片)。
      
    • 每张切片加20～50μL稀释酶标试剂，置湿盒室温反应1～2小时。
      
    • 用0.1M TBS洗10分钟×3次。
      
    • 用0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mM MgC12，pH9.5平衡约5分钟。
      
    • 显色剂配制：将BC1P/NBT储备液用上述缓冲液1∶50稀释。每张切片加20μL，置黑暗处显色，一般显色30～60分钟。信号弱时显色过夜。

附录一：各种溶液的配制
1×SSC：150mM NaCl 15mMSodium Citrate pH7.0。
20×SSC：3M NaCl 300mM Sodium Citrate pH7.0。
10×SSC：1.5M NaCl 150mM Sodium Citrate pH7.0。
Washing Solution 2×SSC：300mM NaCl 30mM Sodium Citrate。
Washing Solution 0.5×SSC：0.5×SSC + 0.1%SDS。
Washing Solution 0.1×SSC：0.1×SSC + 0.1% SDS。
N-Lauroylsarcosine：10%(w/v)in Sterile H20,filtered through a 0.2～0.45μm membrane。
SDS 10%(w/v)in Sterile H2O：filtered through a 0.2～0.45μm membrane。
Denaturation Solution(for Southern transfer)：0.5N NaOH,1.5M NaCl。
Neutralization Solution(for Soutiern transfer)：0.5M Tris-HCl,3M NaCl,pH7.4。
Blocking Reagent Stock Solution：
① 加10g Blocking Reagent至100mL 0.1M TBS，pH7.4缓冲液中。搅拌以助溶解。
② 如果必要时，加0.1%DEPC(dimethylpyrocarbonate)
③ 储备液4℃保存。用前检查有无污染。
Blocking buffer：用0.1M TBS，pH7.4，1:10稀释上述储备液。
Standard hybridization buffer：5×SSC,0.1% N-lauroylsarcosine 0.02% SDS 1% Blocking Reagent。
Standard hybridization buffer+50% formamide：5×SSC,50% deionized formamide,0.1% N-Lauroylsarcosine,0.02% SDS，2% Blocking Reagent。
High SDS Concentration hybridization buffer：7%SDS,50% deionizod formamide,5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,pH7.0,0.1% N-Lauroylsarcosine。
500mL High SDS hybridization buffer 可按下述方法配制：
100% deionized formamide 250mL,30×SSC 83mL,1M sodium Phosphate(pH7.0) 25mL,10% blocking solution100mL，10% N-Lauroylsarcosine 5mL将上述混合液倒入有35g SDS的烧瓶中(通风橱)。搅拦促进溶解，最后加入灭菌水至500mL。储存-20℃。
Detection Washing buffer：0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.4。
Detection buffer： 0.1M Tris-HCl,100mM NaCl,pH9.5。
TE buffer：10mM Tris-HC,1mM EDTA,pH8.0。
Color Substrate Solution(新鲜配制)
200μL BCIP/NBT储备液加10mL Detection buffer。
玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空干燥器中；加1mL二氧二甲基硅烷于一小烧杯中，放入干燥器。将真空干燥器与真空泵相连。抽气至二氯二甲基硅烷沸腾。关闭真空泵，保持干燥器的真空。1～2小时后，慢慢往干燥器内通气，取出器皿180℃烘烤2小时，塑料器高压消毒，用前用水冲洗干净。
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