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Fluo-4 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一，本Fluo-4 AM是配制于无水DMSO中的储存母液，浓度为2mM。

Fluo-4 AM在Fluo-3 AM的基础上改进而成，其特点是加载更快并且在相同条件下荧光更加明亮。Fluo-4 AM将Fluo-3 AM结构中的氯原子替换成了氟原子，导致它的最大激发波长会向短波长处偏离12nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长488nm，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度会比Fluo-3强一倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3相近，所以使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪等荧光检测仪器来测定细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4 AM和Fluo-3 AM的结构式参考图1。

Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-4 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-4 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为512～520nm。Fluo-4的激发光谱和发射光谱参考图2。

用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4 AM的常用浓度为0.5～5μM。通常用含有0.5～5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20～37℃孵育10～60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20～30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成Fluo-4。

• Fluo-4 AM遇水极易分解，建议第一次使用时，母液分装并密封保存，同时注意保持干燥。
  
• Fluo-4 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
  
• 探针的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等需要根据不同实验预先摸索。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

• 取适量Fluo-4 AM母液，用PBS稀释至0.5～5μM的工作液。
  注：工作液须即用即配，请勿反复冻融。
  
• 对于待检测的培养细胞，去除培养液，用PBS或HBSS洗三遍。
  注：因为培养液中的血清含有酯酶会导致Fluo-4 AM分解为Fluo-4，而酚红会导致荧光背景增强。
  
• 加入Fluo-4 AM工作液，溶液量以能充分覆盖细胞为准。
  
• 20℃～37℃孵育10～60分钟进行荧光探针装载。
  注：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37℃孵育30分钟，观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
  
• 随后用PBS或HBSS洗涤3次，洗涤后可以考虑适当再孵育20～30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内完全转变成Fluo-4。
  
• 如有需要，可以使用适当药物来刺激细胞。
  
• 用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、荧光分光光度计或流式细胞仪等荧光检测仪器检测Fluo-4的荧光，以确定细胞内钙离子浓度的变化。