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Cy3 NHS ester，即含N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基团的Cy3，可直接与生化分子上的氨基(-NH2)反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺。

本制品是以磺化染料的形式供货，易溶于水，Ex=555nm，Em=565nm，具有明亮荧光，光稳定性强，pH非敏感性等优点，适用于标记多肽、蛋白以及核酸等生物分子，以通过后续荧光成像以及其他荧光生物学方法分析目的蛋白。

Cyanine 3(Cy3)，是花青素荧光素染料家族的成员之一，是化学合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以两种异构体的形式供货，一种是非磺化花青素(non-sulfonated cyanines)，一种是磺化花青素(sulfonated cyanine)。两者的光谱性质几乎一致，因此大部分应用可相互替换，比如，都可用于标记DNA或蛋白等生物分子。两者的主要区别在于：磺化染料是水溶性的，在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂，并且降低染料在水中聚集的可能性，增强标记效率。

英文别名	Cyanine 3,monosuccinimidyl ester
分子量	829.03
外观	紫色固体
光谱特性	Ex/Em=555nm/565nm
溶解性	溶于DMSO，DMF，水
结构式

组分	规格
Cy3 NHS Ester	1mg
说明书	1份

保存：-20℃，干燥避光，有效期1年。

• NHS ester基团对湿度非常敏感，务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。
  
• NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽(浓度：1～1mg/mL)伯胺的连接反应建议在pH7～9范围内进行。使用不含氨基的缓冲体系，pH7～9。比如100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.5；100mM Hepes,pH7.5。100mM碳酸钠/碳酸氢钠，pH8～9；或100mM硼酸缓冲液，pH8～9。
  
• 不要使用含伯胺的任何缓冲液，比如Tris，甘氨酸。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途!

用Cy3-NHS Ester标记抗体为例。可参考本方法进行多肽，蛋白或者其他分子的标记，需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系，样本浓度，染料浓度等参数做出合适的调整。

• 用不含氨基的合适的缓冲液(eg.100mM磷酸钠，150mM NaCl,pH7.5)溶解抗体使其浓度达到1～5mg/mL。
  注：如抗体中有残留Tris或glycine污染，则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。
  
• 使用前，用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍，例如，待标记的IgG浓度为1mg/mL(eg 6.7μM)，则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM；如待标记的IgG浓度为2.5mg/mL，则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM；
  
• 向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂，以达到预期的标记效率。
  注：当用Cy 3 NHS ester标记抗体或其他蛋白，亮度最高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12，取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景，丧失抗体特异性结合，导致聚集。建议根据应用优化标记比率。
  
• 室温孵育60min(或更长)；
  
• 利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂；
  
• 分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值；
  
• 测定Cy3标记效率(DOL)和标记浓度。利用下面公式计算Cy3标记效率(DOL)及其浓度(mg/ml)。
  
  • Eq.1：Number of Cy3 dye per protein=molarity Cy3 dye/molarity protein
    
  • Eq.2：[Molarity of Cy3 dye]=A555/ε555
    
  • Eq.3：[Molarity of protein]=A280C/ε280
    
  • Eq.4：mg/ml=[A280-(A555×0.08)/(E1%/10)]×dilution factor
  
  
  • A555=conjugate absorbance at 555±2nm
    
  • ε555=molarextinction coefficient Cys dye =150000M^-1cm^-1
    
  • A280= conjugate absorbance at 280nm
    
  • A280C =corrected conjugate absorbance at 280nm= A280-(A555×0.08)
    
  • ε280= molarextinction coefficient protein(M^-1cm^-1)=MWp×E1%/10

用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记0.1mL山羊IgG(浓度为1mg/mL)。标记后脱盐去除未标记染料，在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:
A280=0.2906
A555=0.9825
另：山羊IgG分子量为150kDa,E1%=13.6 or 204000M^-1cm^-1
计算DOL如下：
By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000M^-1cm^-1=6.55μM
By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000M^-1cm^-1=1.039μM
By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55μM/1.039μM=6.3
则计算Cy3-IgG protein浓度为(mg/mL)：
By Equation 4mg/mL=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL
相关搜索：Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯，Cy3-NHS，Cy3 NHS Ester