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Indo-1是一种细胞生物学常用的钙离子荧光探针，与Fura-2为目前使用最广泛的比率法测定的钙荧光指示剂，Indo-1能特异性地结合Ca²⁺，同时可发出荧光，结合Ca²⁺后的最大发射波长从结合前的475nm向400nm(Ca²⁺饱和时)偏移，该信号变化可被流式细胞仪较好的捕捉：在氩离子激光器的351-364光谱范围内单一波长激发该探针，在400nm和475nm的波长处分别检测结合钙离子和未结合钙离子的荧光信号，通过二者荧光强度的比率测定钙离子浓度。

由于Indo-1是极性大的酸性化合物，无法进入细胞内，为此在其负性基团上结合乙酰氧甲酯，使其成为Indo-1,AM，该变化既增加了酯溶性又消除了负电荷，极大的提高了细胞渗透性。在细胞内，Indo-1,AM被酯酶水解成Indo-1后可与胞浆游离Ca²⁺可逆性结合。

CAS号	112926-02-0
分子式	C47H51N3O22
分子量	1009.91
光谱特性	Ex/Em=346nm/475nm
溶解性	溶于DMSO
结构式

• (可选)配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127(货号：SY0881)中加入0.5mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
  
• Hank's balanced salt solution

• Indo-1,AM储存液的配制
  利用高质量无水DMSO溶解Indo-1,AM配制成2～5mM的储存液，该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。
  注：
  ① 因为Indo-1,AM在水中的溶解性和稳定性较差，不可用水溶性缓冲液配制Indo-1,AM储存液。
  ② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
  
• Indo-1,AM工作液的配制
  利用合适缓冲液(如Hanks & Hepes)将Indo-1,AM稀释成1～10μM的工作液，具体稀释方法如1mM母液配制1mL浓度为4μM工作液，用1mL缓冲液稀释4μL 1mM母液即可，混匀。
  注：
  ① 典型工作液浓度为0.1～5μM，对于大多数细胞，我们推荐加载浓度4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
  ② Indo-1,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
  
• (可选)如果Indo-1,AM进入细胞的效果不好，可向Indo-1,AM/DMSO储存液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.02～0.05%，Pluronic F127可以防止Indo-1,AM在缓冲液中聚合并能帮助其进入细胞。
  注：Pluronic F127可降低Indo-1,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
  
• 取出预培养的细胞，除去培养基，使用缓冲液洗涤细胞3次。
  注：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解AM体，从而降低Indo-1,AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
  
• 将Indo-1,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15～60min，然后除去Indo-1,AM工作液。
  注：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
  
• 用不含探针缓冲液洗涤细胞3次，以充分去除残留的Indo-1,AM工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。
  
• 37℃培养箱孵育约20～30min，以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。
  
• 流式细胞仪检测细胞。
  注：
  ①某些细胞会将荧光探针被动运输或分泌到胞外，在一些通过阴离子泵泄漏探针的细胞内该现象尤其严重，此时需加入一些抑制剂防止该情况的发生，如加入适量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制剂的加入量必须经过优化，过量的抑制剂也会对细胞造成不利影响。
  ②某些细胞具有自体荧光会影响结果分析，需使用未加载探针细胞做对照，在结果分析时在同一波长下扣除自荧光。