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原位杂交（ISH）是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体；一个细菌；更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在并定位。本制品就是用于超快DNA探针-RNA模板原位杂交的试剂盒。

• 即开即用，不用用户自己购买原料配制和优化配方。
  
• 有很高的敏感性和特异性（跟探针设计，杂交温度等密切相关）。
  
• 可以用于DNA探针-RNA原位杂交。
  
• 可用于30张切片的原位杂交。

1. 石蜡切片，常规脱蜡至水。冰冻片无需此操作，从第2步开始。
   
2. 暴露mRNA片段：滴加新鲜配制的胃蛋白酶（胃蛋白酶∶蛋白酶稀释液=1:10，现配现用），室温孵育消化2～10分钟（新鲜样本可以考虑不消化，越陈旧的样本消化时间越长）。0.5M PBS洗3次，每次5分钟。蒸馏水洗1次。
   
3. 预杂交：按每张切片20μL加高效核酸杂交液（原位杂交专用）。37℃孵育3.2～4小时。吸取多余液体，不洗。孵育期间一定要保证组织为湿润状态，不得干片（湿盒内加足量的水）。
   
4. 杂交：用自选方法稀释DNA探针（稀释后的杂交液浓度一般为0.5～2μg/mL）。每张切片加20μL稀释好的探针杂交液（需保证覆盖组织，若组织过大，可适量增加杂交液的量），40℃杂交过夜（若此温度阳性结果不明显，可提高杂交温度至60℃，期间需保证组织不得干片）。
   
5. 杂交后洗涤：2×SSC洗涤5分钟，进行2次；0.5×SSC洗涤15分钟进行1次；0.2×SSC洗涤15分钟进行1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
   
6. 封闭：滴加ISH专用封闭液，37℃孵育30min。甩去多余液体，不洗。
   
7. 根据探针标记物，选择相应显色方法显色、复染，脱水、封片。
   
8. 结果观察。

9. 取出细胞爬片，TBS缓冲液浸泡5min。
   
10. 破膜。使用0.25% Triton X-100处理细胞15min，TBS缓冲液洗涤5min进行3次。
    
11. 其余步骤和石蜡切片2～8步相同。

12. 原位杂交实验的样本固定很重要。首先是固定液中需加入0.1%的DEPC，以抑制RNA酶对核酸的分解作用。其次，固定时间建议不要超过6小时（细胞片15分钟即可），过度固定会造成背景加深、阳性减弱、定位不准等不利影响。
    
13. 实验中预杂交和杂交温度较高，需在湿盒中加足量的水以保证样本始终处于湿润状态，切勿干片。
    
14. 如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
    
15. 当其它非特异性染色很明显时，可以用高效核酸杂交液（原位杂交专用）对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2～5倍。