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Fluo-2最早是由Roger Tsien博士发明的钙离子指示剂Fluo系列之一，目前，Fluo-3和Fluo-4已成熟商品化。然而，Fluo-2在细胞内比Fluo-4要更明亮，主要可能是由于大部分细胞对FLuo-2的加载能力要高于FLuo-4。

Fluo-3成像涉及到钙离子信号通路的多个方面，Fluo-3经常应用在流式细胞术上，如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性：Fluo-3可以被氩离子激光器488nm激发，并在与Ca²⁺结合后，发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4是Fluo-3以两个氟原子取代氯原子的类似物，这一微小的结构变化使得Fluo-4探针在488nm激发光下的荧光信号得到增强，信号稳定持续，可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。

Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在与Ca²⁺结合后荧光增强，与紫外激发的探针fura-2和indo-1不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca²⁺结合后，增强至少100倍。

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
   
2. 若单次不能用完，建议分装保存，用封口膜封口，并严格做到≤－20℃密封干燥保存。
   
3. 建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
   
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 工作液配制
   
   1. Fluo-4,AM工作液：使用合适的缓冲液，如HBSS，PBS等将Fluo-4,AM储液(1m M)稀释到1～5μM的终浓度，为了协助非极性的AM酯在水溶液中的扩散，可在Fluo-4 AM工作液中加入适量20% Pluronic F-127，使Pluronic F-127终浓度为0.02%(1：1000稀释)。
      注意：工作液须即用即配，请勿反复冻融。
      
   2. (可选做)有机阴离子转运抑制剂：probenecid(工作液终浓度为1～2.5mM)或sulfinpyrazone (工作液终浓度为0.1～0.25mM)可以添加到工作液，以减少探针在胞外的脱酯现象。Probenecid和sulfinpyrazone储液基本为碱性，因此在添加到工作液时，需要先调整使工作液与所用缓冲液的pH值保持一致。
2. 探针加载与孵育
   
   1. 对于待检测的培养细胞，去除培养液，用PBS或HBSS洗三遍。
      注意：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解AM基团，从而降低Fluo 4-AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
      
   2. 将Fluo-4,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在20～37℃培养10～60min，然后除去Fluo 4-AM工作液。
      注意：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37℃孵育30分钟，观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。一般来说为了减少可能的毒性超负荷，只要满足足够的荧光检测强度，选择尽可能低的染料浓度。
      
   3. 用缓冲液PBS或HBSS洗涤细胞3次，以充分去除残留的Fluo 4-AM工作液。然后加入相应缓冲液覆盖细胞。
      
   4. (可选做)37℃培养箱孵育约20～30min，以确保AM基团在细胞内的完全去酯化作用。
      
   5. 用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长494nm，发射波长516nm。
      注意：Fluo-4，AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-4，并不是以共价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理再进行Ca²⁺水平检测。