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本试剂盒提供了一站式PCR法DNA探针标记用的经过优化的试剂，不需要用户自己摸索标记条件。所得的地高辛标记DNA探针可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。

用PCR对DNA进行地高辛标记的原理是用带地高辛标记的dNTP进行PCR，这些dNTP掺入到PCR产物中之后，扩增得到的DNA片段自然就带有地高辛标记，可以直接用于杂交试验。

• 优化的地高辛掺入率，能有效降低探针中地高辛分子之间的可能空间阻碍，检测效果佳。
  
• 既可用于制备双链DNA探针，也可以用于单链DNA探针。
  
• 一次标记反应可以得到ug级的地高辛标记双链DNA探针或约700ng地高辛标记的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。

• 准备工作
  
  1. 按常规的方法设计PCR引物，使PCR产物(探针)长度在400～800bp之间。过短则地高辛标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
     
  2. 为保证成功率，最好先用常规PCR产物制备DNA片段，再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模板直接进行PCR标记反应。
• 用常规PCR制备模板
  
  3. 用自备的PCR试剂盒按下表设置50μL的常规PCR反应以制备标记PCR模板：
     

     成分	用量
     自备的2×PCR Mix(含酶、dNTP)	25μL
     引物一和引物二(10pmol/μL)	各5μL
     1μg基因组DNA或1ng质粒DNA	1μL
     超纯水	至50μL

  4. 按引物Tm值设计的PCR参数进行常规PCR。
     
  5. 用自备胶回收试剂盒回收常规PCR产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物，避免对后续的标记PCR反应的干扰。
• 标记PCR反应
  

  成分	标记PCR	常规PCR
  标记专用PCR Mix(含酶)	6μL	6μL
  含DIG-11-dUTP的dNTP,2.5mM	5μL	不加
  dNTP Mix，2.5mM	不加	5μL
  若双链标记，加引物一和引物二； 若单链标记，只加一条引物	各50pmol	各50pmol
  胶纯化所得PCR产物	10ng(对双链标记) 100ng(对单链标记)	10ng(对双链标记) 100ng(对单链标记)
  超纯水	至50μL	至50μL

  • 由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记PCR。在设置标记PCR时必须做一个常规PCR对照(本试剂盒足够5次标记PCR和5次常规PCR对照)。
  6. 由于此步所用的PCR引物和第3步的PCR引物完全一样，故可以参考第3步PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35～55个循环，使扩增得到的探针DNA片段参差不齐，杂交时这种DNA能形成网络结构，杂交效果比长度整齐的DNA更好；二是延伸步骤的时间增加15秒，因为标记dUTP掺入到DNA的速度比常规的dTTP慢，增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记dUTP掺入到合成的DNA探针中；三是降低复性温度5～7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，含标记核苷酸的DNA的Tm值将比正常的DNA降低。
     
  7. PCR结束后，取标记PCR反应液和对照反应液3～5μL进行琼脂糖凝胶电泳(一定要使用浓度已知的DNA marker)，检测标记是否成功。由于标记DNA含有额外的标记物、分子量更大，其泳动速度将慢于常规PCR产物。下图是一个典型的双链标记PCR产物和常规PCR产物电泳速度差异的比较图：
     
     图1．标记的DNA(右)与未标记的DNA(左)电泳比较
     
  8. 探针的定量：电泳所用的DNA marker浓度已知(如果不确定，可以问供应商)，上样体积已知，故上样量已知，就可通过双链探针DNA和DNA marker对应条带的相对亮度来估计探针DNA浓度。例如，如果探针长度为500bp，而marker中500bp这条带的浓度是10ng/μL，共上样10μL，则500bp这条带的上样量为100ng。标记的探针DNA在紫外下亮度只有它的一半，则探针DNA的上样量为100/2=50ng，如果上样量是5μL，则探针的浓度是50/5=10ng/μL。但是，如果制备的是单链DNA探针，则不能按此法估计浓度，因为单链DNA结合核酸染料(如EB和SYBR Green I)的能力远低于双链DNA。但可以采用银染法定量(跟marker比较)。一般100ng模板经单链标记PCR扩增可得到700ng左右单链探针。
     
  9. 单链PCR标记产物可以不经过纯化直接加入到杂交液中，双链PCR标记产物需要加热到95～100℃ 5分钟变性然后放冰上急冷后再加入到杂交液中使用。
     
  10. 如果不立即使用，需要放-20℃长期保存，不能放常温保存，否则Taq DNA酶有残留的外切酶活性，探针DNA可能会被降解。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化(参考分子克隆手册)。