PCR法DNA探针标记试剂盒

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BTN90604A

中文名称：

PCR法DNA探针标记试剂盒

英文名称：

PCR DNA Probe Labeling Kit

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1～3天

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PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，最后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验，本试剂盒就是基于上述原理的基础上开发。

一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
一次标记可以得到μg级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
A型需自备含标记核苷酸的dNTP，B和C型分别含生物素和地高辛标记的底物。可用的自备标记底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
掺入率一般为4～5%，有效降低了空间阻碍，检测效果最佳。
标记探针可以用于Southern和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。
本试剂盒足够10次50μL体系的常规PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和5次50μL体系的标记反应。
本试剂盒只能用于科研。

保存：-20℃，有效期1年。

自备试剂

DNA模板和模板专一性引物，常规PCR Mix。

使用方法

准备工作
1. 按常规的方法设计PCR引物，使PCR产物（探针）长度在400～800bp之间。过短则地高辛标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 为保证成功率，最好先用常规PCR产物制备DNA片段，再以之为模板进行标记PCR反应。不推荐以基因组DNA或其他背景复杂的DNA为模直接进行PCR标记反应。
3. 四种10mM的dNTP是分开提供，用于制备50μL非标记dNTP（2mM each，用于非标记PCR，用于制备标记PCR的模板。配制方法是四种10mM的dNTP各加10μL，再加水10μL即可）和25μL标记dNTP（2mM each，其中标记核苷酸和对应的非标记核苷酸的比例需要自行优化，假如是biotin或DIG标记的是dUTP，则其对应的非标记核苷酸是dTTP，两者的最佳比例一般为1∶3；如果是BrdUTP，则两者的最佳比例为1∶1。配制方法是三种10mM的dNTP各加5μL，再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为2mM，再补水到25μL即可）。
非标记PCR产物的制备
1. 设置50μL非标记PCR：2×标记专用PCR Mix 25μL，dNTP Mix（2mM each）5μL，自备的探针引物（10pmol/μL）各1μL，1μg基因组DNA或1ng质粒DNA，补超纯水到50μL。
2. 按已经优化的PCR参数进行常规PCR。
3. 胶回PCR产物并定量，胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记PCR。

标记PCR反应

按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35～55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dUTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5～7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。
标记探针的定量：取标记反应液和对照反应液1～5μL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNA Marker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记产物中额外带有生物素，地高辛等、其泳动速度将慢于非标记PCR产物（但同位素标记不能用此法）。下图是一个典型的双链PCR产物电泳结果图：

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