产品货号：
BTN131036
中文名称：
DNA 5'末端磷酸化试剂盒
英文名称：
DNA 5' End Phosphorylation Kit
产品规格：
20次
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本制品为DNA 5'末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase（T4多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5'末端进行高效标记反应.
- 使用本试剂盒之前，不需要对5'末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase能使5'末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
- 合成的单链或双寡核苷酸的5'末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记（或者只是简单的磷酸化）。
- 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于106cpm/pmol（5'﹣end）的比活性。
- 快速，最快25分钟即可完成标记反应。
- 本制品足够20次20μL体系的填入法标记实验。
- 本制品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| T4多聚核苷酸激酶(10U/μL） | 20μL |
| 5×交换反应缓冲液 | 100μL |
| 10×磷酸缓冲液 | 50μL |
| Control DNA | 20μL |
保存：-20℃，有效期1年。
DNA片段、［γ-32P］ATP或其它的标记、未标记的ATPs、牛小肠碱性磷酸。
一、交换反应
- 实验前需自备的试剂：7M醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
- 在微量离心管中制备下列反应液：
注：5 pmoles的5'末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。成分 用量 自备的5'磷酸化DNA片段 14μL(≤5pmoles的5′末端) 5×交换反应缓冲液 5μL [γ -32P] ATP 5μL T4多聚核苷酸激酶（10U/μL） 1μL 灭菌的超纯水 至25μL - 37℃反应30分钟。
- 70℃加热5～10分钟使酶失活。
- 加入10μL的7M CH3COONH4（pH4.5）。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
- 加入87.5μL（2.5倍）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
- 离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
- 用适当Buffer溶解沉淀。
注：通过第5～8步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时，请在第8步之后进行。
二、磷酸化反应标记
- 去磷酸化反应
- 实验前需自备的试剂：TE饱和酚/氯仿、3M NaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等。
- 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 用量 自备的DNA片段 133μL(≤10μg) 1M Tris-HCl，pH8.0 15μL 牛小肠碱性磷酸酶（CIAP，10～20U/μL） 2μL 灭菌的超纯水 至150μL - 50℃反应30分钟。
- 加入150μL的TE饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀。
- 离心，取上层（水层）移到另一个微量离心管中。
- 重复操作步骤12-13。
- 加入7.5μL的3M NaCl（最终浓度150mM）。
- 加入375μL（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
- 离心回收沉淀，用1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
- 使用20μL的TE Buffer溶解沉淀。
- 实验前需自备的试剂：TE饱和酚/氯仿、3M NaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等。
- 磷酸化反应（前反应）
- 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 用量 自备的DNA片段 133μL(≤10μg) 10×磷酸缓冲液 2.5μL [γ -32P] ATP 1μL T4多聚核苷酸激酶（10U/μL） 1μL 灭菌的超纯水 至25μL - 37℃反应30分钟。
- 下面的操作与交换反应的第4～8步操作相同。
- 在微量离心管中制备下列反应液：
三、合成DNA寡核苷酸的标记
- 在微量离心管中制备下列反应液：
成分 用量 Oligonucleotide DNA with free 5'-OH(5～10 pmoles) ≤3μL 10×磷酸缓冲液 2.5μL [γ -32P] ATP 1μL T4多聚核苷酸激酶（10U/μL） 1μL 灭菌的超纯水 至25μL - 37℃反应30分钟。
- 下面的操作与交换反应的第4～8步操作相同。
- 当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G﹣50层析柱（需另购）对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。
相关搜索：DNA 5'末端磷酸化试剂盒，DNA 5' End Phosphorylation Kit