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本制品是一种NadGreen、溴化乙锭(EB)的升级换代产品，用于凝胶中DNA、RNA等核酸的染色。NadGreen具有安全(未检测到致突变性和细胞毒性)、灵敏度高、稳定性好等优点，凝胶中的核酸在使用本制品后经约500nm波长蓝光(也可以使用约260nm紫外光，但紫外成像条带相对较暗)激发呈现绿色荧光，适用于原先使用SYBR Green或SYBR Gold为核酸染料的凝胶成像和检测系统。NadGreen Plus是NadGreen的增强版，相对于NadGreen，使用方法完全一致，但条带更清晰、更均匀、背景更低，大大降低条带的拖尾和弯曲，而且对条带迁移几乎没有影响，即使上样量很高，也可获得良好的条带分离效果。

由于NadGreen Plus在500nm左右处有最大的激发波长，可以使用对人体无害的蓝光灯或蓝光成像仪进行核酸检测，从而避免常规的紫外检测对核酸样品的致突变性，以及紫外对人的眼睛和皮肤的伤害。特别在切胶回收时，使用NadGreen Plus并用蓝光灯具有很大的优势，不仅可以避免核酸样品的突变，也可以避免紫外光对人体的伤害。

• NadGreen Plus比EB或SYBR Green更安全。
  NadGreen Plus在远高于其工作浓度范围时均没有细胞毒性及诱变性。微型艾姆斯氏试验(Mini-Ames test)结果表明，即使在S9代谢活化时，也没有检测到致突变性。NadGreen Plus、NadGreen和百奥莱博另外一种安全型核酸染料NadRed，由于它们特殊的化学结构使其难以进入细胞，从而大大降低甚至避免了染料的致突变性和细胞毒性。而SYBR Green染料可以穿透细胞膜，进入活细胞并染色DNA。并且有报道SYBR Green可以强烈增强紫外线诱导的基因突变。
  
• NadGreen Plus检测灵敏度高，对于小分子量核酸的染色效果好。
  NadGreen Plus最低可检测1ng的DNA样品，在检测低浓度、微量DNA或RNA方面比EB更佳，尤其对小分子量的DNA检测非常灵敏。在使用浸泡染色法时，NadGreen Plus和SYBR Gold的灵敏度相近甚至更高；与SYBR Gold不同的是，NadGreen Plus预先配制在凝胶中也有很高的灵敏度。EB对于小分子量核酸染色效果差，而NadGreen Plus对于小分子量核酸的染色效果很好，便于观察酶切或PCR获得的小分子量核酸片段。本说明书推荐使用的NadGreen Plus浓度，其检测效果略优于EB。如果希望获得更高的染色灵敏度，可以适当提高NadGreen Plus的工作浓度。
  
• NadGreen Plus的稳定性好，染色重复性高。
  含SYBR Green的凝胶核酸染色的重复性比较差，这通常是由于SYBR系列染料的稳定性差导致的。而NadGreen Plus的稳定性很好，可以室温长时间保存及使用微波炉加热。NadGreen Plus的光稳定性良好，可以在室内正常光线下操作而无需避光。由于其热稳定性和光稳定性，含NadGreen Plus的凝胶在核酸染色时的重复性非常好。
  
• NadGreen Plus可以使用和NadGreen、SYBR Green或EB相同的检测体系。
  NadGreen Plus具有和NadGreen、SYBR Green或SYBR Gold几乎相同的光学性质，激发光和发射光都非常接近，这样可以直接用NadGreen Plus替换NadGreen或SYBR Green，以使用NadGreen或SYBR Green的凝胶观察、拍照或成像系统(约500nm激发)。对于原来用于EB染料观察的系统，可以考虑选用百奥莱博的NadRed染料来替代EB，但也可以使用没有致突变性的NadGreen Plus来替代EB。使用NadGreen Plus来替代EB，并且用EB的紫外检测体系时，检测灵敏度会比使用NadRed低约4～5倍。对于既可以观察EB也可以观察NadGreen或SYBR Green的具有紫外和蓝光两种激发光的凝胶成像系统，则推荐直接用NadGreen Plus来替换EB。NadGreen Plus的激发光谱和发射光谱请参考图1。
  
  图1．NadGreen Plus的激发光谱和发射光谱
  
• NadGreen Plus的使用方法和NadGreen、EB一致。
  NadGreen Plus可以按适当比例直接加入琼脂糖中配制成凝胶，也可以在电泳完毕后对凝胶进行染色。前者更加方便，而后者灵敏度要更加高一些。但由于NadGreen Plus本身已经非常灵敏，通常采用把NadGreen Plus直接配制在凝胶中就可以了。对于一些特殊的情况，如核酸样品量特别少的情况等，则可以考虑电泳后再对凝胶进行染色。
  
• NadGreen Plus对条带迁移几乎没有影响。
  使用NadGreen Plus时，样品的上样量不影响条带美观，即使上样量很高，也可获得良好的条带分离效果。
  
• NadGreen Plus可大大降低条带的拖尾和弯曲，条带更清晰、更均匀、背景更低。
  NadGreen存在一定程度的条带拖尾、弯曲、背景高等现象，NadGreen Plus基本解决了这些问题，而且分子量大的条带也可得到完美的分离效果。
  
• NadGreen Plus染料易去除
  通过凝胶回收试剂盒或酚氯仿抽提，可以有效去除与DNA或RNA结合的NadGreen Plus，从而确保不会影响后续的连接、酶切、PCR、测序等常规的分子生物学用途。

• 为确保使用的不是假冒的NadGreen Plus，可以用细胞培养液把NadGreen Plus稀释至1X，然后对培养的活细胞进行染色。随后在荧光显微镜下尝试用各种激发光观察，如果发现活细胞细胞核出现明显的荧光，则可以判定为假冒产品。如果各种激发光下活细胞均无荧光，则说明该核酸染料是不能进入活细胞的相对安全的染料。具有强致突变性的吖啶橙(Acridine Orange)染色核酸后也呈现绿色荧光，但其可以染色活细胞，而NadGreen Plus不会染色活细胞。
  
• 使用蓝光灯来检测NadGreen Plus染色的核酸胶时，需要注意避免使用一些实为紫外灯的假冒伪劣的蓝光灯，以减少紫外线对于核酸样品和人体的伤害。比较简单的判断方法是，对于EB或NadRed染色的核酸胶，蓝光灯照射后是不会出现荧光条带的，而仅对于NadGreen Plus染色的核酸胶，蓝光灯照射后才会出现荧光条带。如果对于EB或NadRed染色的核酸胶照射后也能观察到荧光条带，则说明使用的蓝光灯实际为紫外灯。
  
• 琼脂糖凝胶中添加NadGreen Plus制备的凝胶为浅橘红色，电泳后肉眼观察胶颜色可能出现不均一的情况，例如上半部分胶颜色深，下半部分胶颜色浅，这属于正常现象，不影响电泳结果。
  
• 制备好的NadGreen Plus琼脂糖凝胶，在4℃避光条件下通常可以保存3～5天。
  
• NadGreen Plus琼脂糖凝胶再次熔化使用时，为取得更好的观察效果，需要添加适量NadGreen Plus。
  
• 电泳之后的凝胶不建议重复使用。
  
• 电泳后再使用NadGreen Plus染色的凝胶一般不需要脱色，如果发现背景太高，可以使用不含核酸酶的水进行脱色处理。
  
• NadGreen Plus和NadGreen、NadRed一样除了可以染色双链DNA外，也可染色单链DNA和RNA。NadRed对单链核酸的染色灵敏度约为对双链DNA染色灵敏度的一半。NadRed对单链核酸的染色灵敏度约为NadGreen Plus的5倍。
  
• 如果使用聚丙烯酰胺凝胶，请使用浸泡染色法染胶，并延长染色时间至30分钟～1小时。
  
• 如果观察到条带弥散或者分离不理想，建议使用浸泡染色法染色以确认是否与染料有关。如果浸泡染色法染色后仍然出现类似的问题，说明与染料无关，请尝试以下方法：使用新鲜配制的电泳缓冲液、降低核酸的上样量、降低染料的浓度、降低琼脂糖浓度、选用更长的凝胶、降低电泳电压一倍以上并延长凝胶电泳时间以改善电泳效果、使用更薄的梳齿等。
  
• 本制品兼容常用的电泳缓冲液，例如TAE和TBE。
  
• NadGreen Plus适用于约500nm或260nm激发的成像系统，如果使用普通的适用于NadRed或EB的紫外灯或成像系统(约300nm激发)，也能较好地观察到荧光，但强度会略弱一些。
  
• NadGreen Plus不属于有毒有害物质，并通过了环境安全相关测试，相关废弃物无需特殊处理，可参考常规化学试剂进行处理。

• 琼脂糖凝胶中添加NadGreen Plus。
  根据需要配制适当浓度(例如1～3%)的琼脂糖胶液。在琼脂糖完全融解后，适当冷却但又不会使琼脂糖凝固时，按照每100mL胶液加入50μL NadGreen Plus的比例(2000:1)加入NadGreen Plus。混匀后即可把琼脂糖胶液倒入制备凝胶的模具中。适当量的DNA或RNA在该胶中电泳后，用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测(也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统)，就可以观察到明亮的核酸条带。
  说明：NadGreen Plus非常稳定，所以NadGreen Plus可以像EB一样在琼脂糖凝胶液加热融解后但未凝固前加入并混匀，也可以在琼脂糖融解前加入然后再微波炉加热融解并混匀。
  
• 电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色。
  按照每100mL 100mM NaCl溶液或水中加入100～200μL NadGreen Plus的比例(500-1000:1)加入NadGreen Plus，配制成NadGreen Plus染色液。把电泳完毕的琼脂糖凝胶放到适当的容器中，加入适量上述配制好的NadGreen Plus染色液，确保至少盖住凝胶。在摇床上缓慢摇动(30～50rpm)染色20～30分钟。染色的时间根据胶的厚度而定，胶厚则染色时间需要长一些，胶薄则染色时间可以短一些。染色完毕后，在紫外灯下即可观察核酸条带。要观察到更为清晰的条带，可以在染色后用水漂洗1～2次，每次3～5分钟，以消除背景，然后用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测(也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统)。NadGreen Plus染色液可以重复使用3次左右。NadGreen Plus染色液也可以一次大量制备，在室温下避光保存，直至用完。对于核酸需要回收的情况，操作过程中需要注意避免核酸酶污染。