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Alexa Fluor 647是一种明亮且光稳定的远红外荧光染料，其激发光谱非常适合于633nm激光谱线。Alexa Fluor 647染料用于成像和流式细胞分析中稳定信号的生成，具有水溶性和pH值不敏感性(pH4～10)。该长波长Alexa Fluor染料的荧光人眼不可见，但很容易被大多数成像系统检测到。

NHS活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-hydroxysuccinimide ester，succinimidyl ester,SE)是生物标记反应中最常用的活化基团。NHS活化TAMRA分子中的羧基，让它可以和目标生物分子上的胺基（主要伯胺）反应生成稳定的酰胺键，从而把AF647荧光分子标记到生物大分子上。

CAS号	407627-60-5
分子式	C40H46K3N3O16S4
分子量	1070.36
结构式
光谱特性	Ex/Em＝651/672nm
消光系数	270,000L·mol-1·cm-1
量子产率	0.33
外观	深蓝色固体
溶解性	易溶于水、DMSO、DMF等

AF系列，即Alexa Fluor系列染料是一类非常著名的高性能荧光染料。AF染料由19种染料组成，荧光涵盖了全部可见光区以及近红外1区的波谱范围。从化学结构上看，虽然AF系列包含有香豆素、罗丹明、花青素等各种荧光母核的染料，但是它们都有一个共同特点：都是高度磺化的染料，水溶性强、荧光很亮、对pH不敏感(pH4～10)，因此是一类高性能的蛋白标记染料。

和sulfo-Cy系列水溶性染料相比，AF染料具有更多的磺化官能团，比如Sulfo-Cy5含有2个磺酸根基团，但是对应的AF647染料含有4个磺酸根基团，足足多了1倍。大量的磺酸根离子不仅赋予了AF染料更高的水溶性，更重要的是大大提高了标记染料的荧光性能。磺酸化可以提高染料本身的消光系数和量子产率(两者直接与染料的荧光亮度正相关)，也可以强化染料标记产物的荧光性能。比如普通染料在标记蛋白质后，由于处于蛋白表面的染料倾向于疏水性聚集，染料荧光会淬灭变弱；而AF染料因为多磺酸化的高水溶性和负电荷排斥作用，蛋白表面的染料倾向于分散而不是聚集，产物的荧光强度会随着标记的程度倍增，另外AF染料标记的蛋白质也更稳定，更容易保存。

琥珀酰亚胺酯(succinimidyl esters)，也常叫做se或NHS活化酯，是最常见的活化官能团，可和氨基反应，生成稳定，无毒的酰胺键。AF染料琥珀酰亚胺酯以干燥固体的形式实现稳定储存，可随时与溶剂(有机溶剂或者水)复溶后对氨基官能团进行染料标记。标记反应可以在有机溶剂中进行，也可以在缓冲盐中或者缓冲盐和有机溶剂的混合溶剂中进行，可根据标记对象的水溶性和稳定性决定。NHS活化酯主要和伯氨基反应，比如多肽N端和蛋白质中的赖氨酸侧链氨基，与其它氨基的反应活性都比较小，比如和苯氨基、苯酚、醇羟基都不反应。另外，NHS活化酯优于其它氨基标记基团，比如异硫氰酸酯(isothiocyanate)，因为NHS反应活性更强，选择性高，并且生成的酰胺键和肽键结构一样，很稳定，比异硫氰酸酯生成的异硫氰酸酰胺(如FITC标记)要牢靠。

• 琥珀酰亚胺活化酯对湿气敏感，在含水条件下会缓慢水解为羧酸，失去对氨基的标记能力。活化酯一般在-20℃干燥保存，使用前请预先从冰箱中取出，平衡到常温后再打开瓶盖。NHS活化酯用无水溶剂(如无水DMSO、无水DMF)溶解后也无法长时间保存，应尽快使用(尽量24h内)，因为溶剂中残留的微量水分子也会让活化酯水解。
  
• 活化酯在水溶剂中水解的半衰期随pH而变化，在微碱性条件下半衰期约0.5～1h；在微酸性下，半衰期可长达5小时以上。NHS活化酯与氨基的反应活性也与pH有关，一般碱性下反应快，酸性下反应活性弱，所以一般推荐是在中性或者微碱性缓冲液中进行标记反应，以达到最佳的水解速率和反应活性平衡。
  
• 常见添加剂，比如叠氮化钠(≤3mM or 0.02%)或thimerosal(≤0.02mM or 0.01%)，对蛋白标记反应没有影响，但是20～50%的甘油会降低标记反应效率。此外，Tris、甘氨酸等带伯氨基的缓冲盐会让NHS活化酯试剂失活，严禁在此类溶液中进行标记反应。

• 准备工作：
  
  • 反应体系溶剂AF染料由于水溶性强，不需要有机溶剂助溶，可在水溶液中标记，避免有机溶剂对生物样品的刺激和伤害。如果希望短期保存染料，可以先将染料溶于少量无水DMSO，然后取少量染料有机溶液，置于水溶液样品中，即混合溶剂(水溶液+少量有机溶剂)，进行标记。NHS活化酯在微碱性条件下反应的活性比较高，综合考虑反应速度和活化酯水解速度，一般选择在pH7.0～8.5左右的pH值范围进行标记反应。最优化的反应缓冲盐是50mM的硼酸钠溶液(50mM Na3BO3,pH8.5)。除此以外，磷酸钠缓冲盐PBS(0.1M Na3PO4,0.15M NaCl,pH7.2～7.5),NaHCO3溶液(0.1M NaHCO3,pH8.3～9.0)也可以用于标记反应。带有氨基的缓冲液(例如Tris或甘氨酸)会自身和NHS活化酯反应，所以不可使用，如果蛋白样品中含有这些缓冲盐，必须通过透析或者除盐柱将这些氨基盐除掉后才可以用于标记反应。
    
  • 染料母液配制AF系列NHS活化酯染料对湿气很敏感。为了避免空气中水汽在低温样品表面凝结失活样品，低温冰箱中取出的活化酯在室内放置到室温后再打开瓶盖使用。NHS活化酯染料不建议配置母液，而是应直接投入水溶液进行标记反应，直接在水溶液中进行标记反应不会影响标记效率。如果必须配置AF染料母液，一般推荐用无水DMSO溶解，母液浓度为10mg/mL。母液也可以配制为1mg/mL或者其它浓度，以便更准确的移液操作。
    
  • 染料标记比例为实现每个蛋白标记大于1个染料分子的目标，在反应体系中，染料/标记对象的摩尔比例一般是5～10∶1；个别情况可以降低到约3∶1。为提高标记效率，应尽可能在高浓度、小反应体积条件下中进行，比如标记蛋白质，蛋白质的浓度最好在1～10mg/mL。水溶液中的标记反应，就是NHS活化酯的水解反应与氨基标记反应的赛跑，蛋白质浓度高时，NHS活化酯更多机会碰撞到氨基(存在于蛋白质表面)，反应机会多，效率就高。上述推荐比例仅仅是多荧提供的参考比例，具体比例需根据个人预实验摸索后决定，因为蛋白标记的效率与蛋白结构、反应体积、反应溶剂、实验温度、反应时间和纯化方式都有关系。标记后的蛋白以每个蛋白分子上偶联1～4个染料为最佳(视蛋白稳定性和大小而定)，标记过多会影响蛋白的活性和稳定性，严重时会变性沉淀。
• 标记反应步骤：
  
  • 将需要标记的蛋白质溶液转移到反应小管中。
    
  • 根据染料标记摩尔比例，将蛋白溶液与染料混合，用移液器上下轻轻打动混匀，或者轻微超声1～2秒，使染料完全溶解。常温下静置或轻微晃动，反应1～5小时，反应时间延长有助于提高标记效率，最多可以标记过夜。对于蛋白质等敏感材料，反应中的有机溶剂体积比最好控制在5%以下，不建议超过10%。
    
  • 利用透析，或者除盐柱，除去未标记的游离染料分子。也可以采用硫酸铵沉淀法(大量蛋白样品时)或乙醇沉淀法(标记样品是核酸时)等方法纯化样品。透析时，为了快速的透出染料分子，请采用至少截留分子量>10KDa的透析袋，最好每4个小时更换透析液，重复更换3次。凝胶过滤法，比如除盐柱，也可以纯化蛋白标记，虽然这个方法比较快捷，但是效率可能会不如透析法。
    
  • 在避光条件下，将纯化后的蛋白样品溶液可短期储存在4℃冰箱。或者加入冷冻保护剂(比如甘油)、分装后放入-20℃冰箱，长期保存。
• 计算标记反应程度：
  每种染料都有一个特定的消光系数e。通过测定最大激发峰(即最大吸收峰)的吸收值，并结合这个ε参数，可以精确计算出染料分子的浓度，再除以蛋白的浓度就可以得到染料标记的程度(即每个蛋白平均标记了几个染料分子)。
  
  • 利用BCA或者其他蛋白质测定试剂盒测定标记后的蛋白质浓度，并根据蛋白质分子量，计算出样品蛋白质的摩尔浓度C_potein。
    
  • 查询附录参考的AF染料光学特性表，找到染料最大吸收峰的波长(即Ex的数值，比如AF555染料的是555nm)。在紫外分光光度计上面，采用1cm光程的比色皿，测定最大吸收峰的吸收值A_max。染料对光的吸收很强，测量前一般要将少量样品取出进行稀释再测吸收值。根据吸收值，计算染料分子的摩尔浓度，C_dye=(A_max×稀释倍数)/消光系数ε，单位是M(mol/L)。
    
  • 计算标记程度，即n=C_dye/C_protein。
    注意：务必将蛋白质和染料的浓度换算成统一单位后再计算。