Cy2-NHS酯

产品货号：

YF0100

中文名称：

Cy2-NHS酯

英文名称：

Cyanine2 NHS Ester

产品规格：

1mg|3mg|5mg|25mg

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本产品是Cyanine2荧光染料的NHS活化酯。可以直接和各种标记对象中的氨基反应，生产稳定的酰胺键。

背景资料

Cy2是一种发射绿色荧光的荧光染料，光学性质与罗丹明绿、FITC、AF488类似。它是Cy系列染料中仅有的以苯并恶唑为发色团的染料，正因为如此，尽管它有和Cy3相同长度的次甲基桥链，但是它的吸收峰和发射峰蓝移了约70nm，到达黄绿色光谱区，使它成为Cy系列菁染料中唯一发绿色荧光的染料。Cy2有很多优点，在非极性和极性环境中荧光都很强，可以支持DPX和Permount等非极性有机封片剂，荧光核化学结构较稳定，可适配各种常规仪器的绿色荧光通道，可标记各种纳米材料和生物样品等。
Cy2荧光光谱图

CAS号：186205-33-4
分子式：C₂₉H₃₀IN₃O₆
分子量：643.47
外观：桔红色固体
光谱特性：Ex/Em=484nm/504nm(PBS/乙醇混合液)
溶解性：易溶于甲醇、DMF等有机溶剂
保存：-20℃，避光，干燥

注意事项

琥珀酰亚胺活化酯对湿气敏感，在含水条件下会缓慢水解为羧酸，失去对氨基的标记能力。活化酯一般在-20℃干燥保存，使用前请预先从冰箱中取出，平衡到常温后再打开瓶盖。NHS活化酯用无水溶剂（如无水DMSO、无水DMF）溶解后也无法长时间保存，应尽快使用（尽量24h内），因为溶剂中残留的微量水分子也会让活化酯水解。活化酯更不能在水溶剂中保存。
常见添加剂，比如叠氮化钠（≤ 3mM or 0.02%）或thimerosal（≤ 0.02mM or 0.01%），对蛋白标记反应没有影响，但是20～50%的甘油会降低标记反应效率。此外，Tris、甘氨酸等带伯氨基的缓冲盐会让NHS活化酯试剂失活，严禁在此类溶液中进行标记反应。

下面是以标记蛋白质为例，讲述NHS活化酯染料的常规标记方法。对于特殊标记条件和要求，可以根据实验情况个体优化。

标记准备工作：
- 反应体系溶剂
  标记一般在混合溶剂（水溶液+少量有机溶剂）中进行。sulfo-Cy由于水溶性强，不需要有机溶剂助溶，可在水溶液中标记，避免有机溶剂对生物样品的刺激和伤害。
  NHS活化酯在微碱性条件下反应的活性比较高，综合考虑反应速度和活化酯水解速度，一般选择在pH8.5左右的pH值范围进行标记反应。最优化的反应缓冲盐是50mM的硼酸钠溶液（50mM Na3BO3,pH8.5）。除此以外，磷酸钠缓冲盐PBS（0.1M Na3PO4,0.15M NaCl,pH7.2～7.5）,NaHCO3溶液（0.1M NaHCO3,pH8.3～9.0）也可以用于标记反应。带有氨基的缓冲液（e.g.Tris或甘氨酸）会自身和NHS活化酯反应，所以不可使用，如果蛋白样品中含有这些缓冲盐，必须通过透析或者除盐柱将这些氨基盐除掉后才可以用于标记反应。如果标记对象是高分子、小核酸等耐有机溶剂材料，标记反应也可以在纯有机溶剂体系（比如甲醇、乙腈或者氯仿等）中进行，纯有机溶剂体系可以降低NHS活化酯的水解速度，从而在较低的染料/对象比例下实现高效标记（需加入有机碱比如三乙胺促进反应进行）。
- 染料母液配制
  Cy系列NHS活化酯染料对湿气很敏感。为了避免空气中水汽在低温样品表面凝结失活样品，低温冰箱中取出的活化酯在室内放置到室温后再打开瓶盖进行母液配制。
  染料一般用无水DMF或无水DMSO溶解，推荐母液浓度为10mg/mL。母液也可以配制为1mg/mL或者其它浓度，以便更准确的移液操作。如果对一些特别敏感的蛋白质样品，推荐使用sulfo-Cy系列染料，这样可以将染料直接加入反应水溶液体系中，回避使用有机溶剂。
- 染料标记比例
  为实现每个蛋白标记大于1个染料分子的目标，在混合溶剂反应体系中，染料/标记对象的摩尔比例一般是5-10/1；纯有机溶剂体系中可以降低到约3/1。为提高标记效率，应尽可能在高浓度、小反应体积条件下中进行，比如标记蛋白质，蛋白质的浓度最好在1～10mg/mL。
标记反应步骤：
- 将需要标记的蛋白质溶液转移到反应小管中。
- 根据染料标记摩尔比例，加适量的染料母液入反应小管中，用移液器上下轻轻打动混匀。
  常温下静置或轻微混动，反应1～5小时，反应时间延长有助于提高标记效率，最多可以标记过夜。对于蛋白质等敏感材料，反应中有机溶剂体积比控制在5%左右，如果有大量染料析出（疏水性Cy染料），可适量增加体积到10%或更高，如果是磺化染料，也可以在水中直接标记。
- 利用透析，或者除盐柱，除去未标记的游离染料分子。也可以采用硫酸铵沉淀法或乙醇沉淀法等方法纯化样品。透析时，为了快速的透出染料分子，请采用至少截留分子量>10KDa的透析袋，最好每4个小时更换透析液，重复更换3次。凝胶过滤法，比如除盐柱，也可以纯化蛋白标记，虽然这个方法比较快捷，但是效率可能会不如透析法。
- 在避光条件下，将纯化后的蛋白样品储存在4℃冰箱，可至1个月。或者加入冷冻保护剂、分装后放入-20℃冰箱，长期保存。
计算标记程度：
每种染料都有一个特定的消光系数ε。通过测定最大激发峰（即最大吸收峰）的吸收值，并结合这个ε参数，可以精确计算出染料分子的浓度，再除以蛋白的浓度就可以得到染料标记的程度（即每个蛋白平均标记了几个染料分子）。
- 利用BCA或者其他蛋白质测定试剂盒测定标记后的蛋白质浓度，并根据蛋白质分子量，计算出样品蛋白质的摩尔浓度C_protein。
- 查询首页的Cy染料光学特性表，找到染料最大吸收峰的波长（即Ex的数值，比如Cy3染料的是554nm）。在紫外分光光度计上面，采用1cm光程的比色皿，测定最大吸收峰的吸收值A_max。染料对光的吸收很强，测量前一般要将少量样品取出进行稀释再测吸收值。根据吸收值，计算染料分子的摩尔浓度，C_dye = (A_max×稀释倍数)/消光系数ε，单位是M(mol/L)。
- 计算标记程度，即n = C_dye/C_protein。注意，务必将蛋白质和染料的浓度换算成统一单位后再计算。

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