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革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，脱色液脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此脱色后再经番红复染，呈红色。

• 标本涂片不宜太厚，建议按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，至不再出现紫色为止。
  
• 玻片通过火焰温度不能太高。碘液变透明，则不能使用。
  
• 如无油镜观测条件或切片须长期保存，可于晾干后滴加中性树脂封片，40倍镜观察。
  
• 水洗时动作要轻柔，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
  
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解，都常呈阴性反应。

• 涂片固定：准备洁净、干燥的载玻片，菌液涂片固定，固定时通过火焰3～4次即可，不可过热，以载玻片不烫手
  为宜。
  
• 染色：一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。
  
  • 滴加结晶紫染色液后，染色1分钟，水洗。
    
  • 滴加碘液后染色1分钟，水洗。
    
  • 滴加脱色液，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20～60秒，水洗，吸去水分。
    
  • 滴加番红染色液后，染色1分钟，水洗。
    
  • 滤纸吸干多余水分或在空气中晾干后，100倍油镜镜检。