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FerroFarRed是一种特异性检测不稳定的铁(II)离子（Fe2+）的荧光探针。FerroFarRed基本无荧光，一旦与Fe2+反应后，不可逆的生成一种远红荧光产物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，图1.FerroFarRed的光谱特征）。生理浓度下的铁（III）离子（Fe3+）或其它除铁离子以外的二价金属离子都不会使其荧光增强（见图2.FerroFarRed的金属离子反应特异性）。FerroFarRed具细胞膜渗透性和高选择性，且在高达100μM的浓度下对细胞几乎无毒性，适用于活细胞内Fe2+的检测，倾向定位在内质网（ER）。适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、荧光酶标仪以及流式细胞仪（配置红色激光器）分析。

• FerroFarRed倾向定位在内质网，但也可能检测细胞质池内的Fe2+，目前针对这一点未做明确评估。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 需要自行准备的材料
  
  • 细胞培养级或超纯DMSO
    
    • 强烈建议将高纯的DMSO分装成单次用量保存在极低温冷冻室内，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能会增加FerroFarRed的背景信号。
  • 合适的观察缓冲液（比如：PBS,pH7.4；HBSS；等）。不要含酚红。
    
  • 无血清细胞培养基（D-MEM等）
• 探针准备
  
  • 从冰箱取出FerroFarRed，置于室温回温至少30min，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。
    
  • 往一管FerroFarRed（50nmol）内加入50μL高质量DMSO，用枪反复吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mM FerroFarRed储存液。
    
    • FerroFarRed是蓝色固体，但溶液几乎无色（浅蓝色）。
      
    • 建议单次用完储存液，若实在用不完，请根据单次用量分装，置于-80℃避光保存。用中性缓冲液来稀释储存液。
• HeLa细胞Fe2+的染色步骤（荧光成像分析）
  
  • 在玻底培养皿内接种细胞，培养过夜。
    
  • 从培养皿内吸走培养基，用合适的观察缓冲液（比如：HBSS）清洗两次。
    
  • 用无血清细胞培养基稀释1μM FerroFarRed储存液，制备成5mM的染色工作液。
    
  • 将染色工作液加入培养皿内，于37℃孵育1h。
    
    • 建议根据细胞类型和自身实际需求优化工作浓度和孵育时间。
      
    • 如果细胞很容易从培养皿上脱落，建议使用多聚L-赖氨酸或其它包被基质包被的培养皿来接种细胞。
  • 染色后用观察缓冲液（比如：HBSS）清洗一次，替换成新的观察缓冲液。
    
  • 在荧光显微镜下观察细胞。
• HepG2细胞Fe2+的测定（流式分析）
  
  • 于多孔培养板内接种细胞，过夜培养。
    
  • 从培养板内吸走培养基，用合适的观察缓冲液（比如：HBSS）轻轻的清洗两次。
    
  • 用无血清细胞培养基稀释1μM FerroFarRed储存液，制备成5mM的染色工作液。
    
  • 将染色工作液加入培养板内，于37℃孵育1h。
    
    • 建议根据细胞类型和自身实际需求优化工作浓度和孵育时间。
  • 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25%胰酶-EDTA消化细胞。
    
  • 于冰上用PBS稀释0.25%胰酶-EDTA，之后500×g离心细胞悬液5min，以沉淀细胞。
    
    • 不可用血清来中和胰酶。
  • 吸走上清，用PBS重悬细胞。
    
  • 用细胞筛网（40μm尼龙筛网）过滤细胞，去除细胞碎片。
    
  • 上机，流式细胞仪分析。
• 荧光检测
  对于激光激发：635nm波长左右的激光器比较适合。荧光在660nm左右观察。
  对于荧光显微镜观察：选择检测Cy5的红色激发滤片。对于流式分析，选择检测APC的滤片。