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Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca²⁺荧光探针。类似于Fluo-3或Fluo-4，其激发和发射光谱不会随着Ca²⁺浓度变化发生明显的迁移，荧光信号一旦与Ca²⁺结合后明显增强。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波长更长（Ex/Em=549/578nm），这一特性使其更适合具高水平自荧光信号细胞或组织的Ca²⁺水平检测，还可用来检测由光感受器和笼锁Ca²⁺螯合剂光激活导致的Ca²⁺释放。

Rhod-2,AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-2，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2～5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

• 长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容；
  
• 特别定位在线粒体。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察加载进入细胞呈现点状染色模式。有文献认为，Rhod-2是线粒体Ca²⁺的选择性探针，不过这一理论并未得到广泛支持。
  
• 检测平台：荧光成像，流式细胞术，酶标仪，高内涵筛选（HCS）。

CAS号	129787-64-0
化学名	9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium,monobromide
同义名	Rhod-2,Acetoxymethyl Ester
分子式	C52H59N4O19Br
分子量	1123.96
结构式
外观	红色固体
光谱特性	最大激发/发射波长：549/578nm
Kd	570nM（Ca2+结合）
溶解性	溶于DMSO(2～5mM)

• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• Rhod-2从低浓度Ca²⁺到高浓度Ca²⁺的荧光增强程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的荧光信号弱于Fluo-3。
  
• 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
  
• Rhod-2,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20～25℃温育片刻至全部融解后使用。
  
• Rhod-2,AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 试剂准备
  
  • 配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末(货号：KM0188)中加入500μL DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
    
  • HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液。
• 操作步骤
  
  • 用无水DMSO溶解Rhod-2,AM配制成2～5mM的储存液，或将已配好的Rhod-2,AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Rhod-2,AM中加入11.1μL无水DMSO）。准备Rhod-2,AM工作液之前，有时需要往Rhod-2,AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。
    
    • Rhod-2,AM染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2,AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。
      
    • Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。
  • 用HHBS或其他生理缓冲液将Rhod-2,AM+DMSO储存液稀释到1～10μM的工作液。
    
    • Rhod-2,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
      
    • Rhod-2,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
  • 可选步骤：如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1～2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1～0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。
    
    • 丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。
  • 将准备好的Rhod-2,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min～2h。
    
    • 若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod-2,AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2～3次。
      
    • 关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
      
    • 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
  • 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1～2次，以去除残留探针。
    
  • 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
    
  • 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=549/578nm来进行检测。