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Enhanced NaTrium Green-2 AM (ENG-2 AM)是Asante NaTrium Green-2 AM（ANG-2 AM）的替代物，是一种具细胞膜渗透性的新型钠离子（Na+）荧光探针。一旦进入细胞后，经非特异性酯酶水解生成水溶性形式的探针。不同于传统Na+探针SBFI，ENG-2是一种可见光光谱范围的探针，激发波长范围是488～525nm，发射波长是545nm。

ENG-2 AM具有容易加载、缓慢泄露、良好光稳定性和宽动力学范围等理想特征，也正好弥补传统Na+荧光探针SBFI AMSBFI AM的缺陷。

• 使用无水DMSO溶解ENG-2 AM（Mw：1084g/mol）配制成1～5mM储存液，比如往50μg ENG-2 AM冻干粉内加入23μL DMSO，充分溶解后配制成2mM储存液。-20℃分装干燥冻存，避免反复冻融。
  
• 通常在含适当浓度AM探针的无血清培养基中实现探针加载。建议正式实验前向加载培养基内加入Pluronic F-127以促进AM探针的分散。可用DMSO配制20% Pluronic F-127储存液或其他浓度，只需在正式实验前将其与ENG-2 AM储存液混合，然后加入加载培养基，保证其终浓度＜0.1%（w/v）。
  
• 室温或37℃孵育细胞（可能在室温的探针加载质量会高些），孵育浓度通常为1～10μM，孵育时间通常为30～60min，具体的请根据实际情况或参考文献资料。
  
• 可选：对于大分子量AM探针（分子量≥1000g/mol），孵育结束，加入不含AM探针的细胞加载培养基额外孵育20～60min，以确保细胞将AM基团完全去酯化。
  
• 用不含血清和探针的培养基清洗细胞至少一次，以降低细胞外背景荧光。
  
• 最后用合适的仪器来检测荧光信号。最大激发波长525nm，最大发射波长545nm。

• 如果细胞加载培养基是以碳酸氢钠为缓冲体系，那么加载需要含5% CO₂的环境内进行，以防止因CO₂损失引起的培养基碱化。
  
• 如果细胞加载培养基含血清，那需适当提高AM探针工作浓度，以补偿因AM探针与血清蛋白结合引起的损失。
  
• 某些情况下，对分子量接近或超过1000的AM探针，需用不含AM探针的细胞加载缓冲液进一步孵育20～60min，以保证细胞内酯酶能充分降解AM基团。
  
• 探针的加载时间和浓度因具体的细胞类型而有差异，请根据具体的细胞类型来优化。
  
• 对每一种探针有必要通过校准（calibration）来得到实际解离常数（Kd）。物理条件如温度，pH，离子强度或溶液粘度，以及探针与细胞组成成分如蛋白质的相互作用，都会影响Kd值。实际情况细胞内的Kd比体外溶液通常要高。因此，细胞水平研究有必要进行校准确认实际Kd值。
  
• 对于ENG-2，虽然最大激发波长在525nm，但其极强的荧光亮度使其能够用标准的488nm滤片来激发，与Fluo系列的可见光钙离子指示探针检测手段一致。值得注意的是，488nm激发下得到的荧光强度约为最大激发波长下的40%。

• ENG-2 AM易受潮，粉末需干燥保存；
  
• ENG-2 AM储存液可用DMSO溶解，不推荐长期保存，甚至是-20℃。建议条件允许，最好现配现用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。