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通用型miRNA克隆接头(5'腺苷化、3'封闭)图片
产品货号:
YTB4300
中文名称:
通用型miRNA克隆接头(5'腺苷化、3'封闭)
英文名称:
Universal miRNA Cloning Linker(5'adenylated, 3'blocked)
产品规格:
1μg|5μg
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是一种常用于miRNA等3′端为羟基的RNA或3′端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时,在3′端添加的接头。

本产品5′端腺苷酰化(也称5′端预腺苷酰化或5′端预腺苷化,5′pre-adenylated或5′pre-adenylation),3′端氨基封闭,可以用于3′端为羟基的RNA的3′端接头的添加。RNA连接酶可以识别“活化”的5′端腺苷酰化的本产品,在无需ATP存在的条件下,可将本产品的5′端与另外一条单链寡核苷酸的3′端羟基共价连接。利用5′端腺苷酰化,3′端封闭的本产品,加入RNA连接酶,在无需添加ATP的条件下,就能实现本产品5’端和目标序列3’羟基的特异性共价连接。例如和miRNA连接时,可以有效避免miRNA的自连、不同miRNA之间的连接、本产品的自连或本产品不同链之间的连接,而仅发生本产品5′端和miRNA 3′羟基之间的特异性连接。

本产品的1μg小包装约通常可以进行8~17次连接反应,5μg中包装约通常可以进行40~85次连接反应。具体的连接反应次数和反应体系的体积和本产品的用量有关。

使用效果:
本产品的电泳图和连接效果图请参考图1。图中可见,本产品条带清晰,纯度高,与5’端为磷酸化的序列相比有显著的电泳迁移率差异(图1A);并且本产品使用T4 RNA ligase II(截短型,货号:YTB4028)与ssRNA连接时,连接效率非常高(图1B)。
通用型miRNA克隆接头(5′腺苷化3′封闭)
图1.Universal miRNA Cloning Linker Linker (5′腺苷化3′封闭)及其连接效果图图。图A.本产品5′-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3′ (AppDNA)与5′-pCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3′ (pDNA)的电泳对比图。图B.本产品(AppDNA)与ssRNA使用T4 RNA ligase II(截短型,货号:YTB4028)的连接效果图。图中可见本产品与ssRNA有非常高的连接效率。

技术指标:
序列:5′-rAppCTGTAGGCACCATCAAT-NH2-3′
浓度:水溶液,浓度为40ng/μL,即6.9μM。
用途:可以应用于小RNA克隆、miRNA文库构建。
保存:-20℃保存,一年有效。-80℃保存,至少一年有效。

使用说明:
  • 使用本产品与ssRNA的3’羟基末端连接推荐使用T4 RNA ligase II(截短型,货号:YTB4028)。
  • 参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
    成分用量终浓度
    ssRNAxμl0.5μM
    DEPC-treated Water(1.1 or 2.55)-xμl-
    Universal miRNA Cloning Linker (6.9pmol/μl)2.9 or 1.45μl1 or 0.5μM
    PEG8000 (50%,RNase Free)12μl0.3
    10X Reaction Buffer2μl1 X
    RNase Inhibitor (40U/μl)1μl2U/μl
    T4 RNA ligase II
    (截短型,200U/μl,货号:YTB4028)
    1μl10U/μl
    Total Volume20μl-

    注意:
    • 由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DECP处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor,以避免ssRNA或其连接产物的降解,尽管经测试我们发现在严格操作的情况下,不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
    • 进行连接反应时,如果样品RNA比较珍贵,希望充分被连接,可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接;如果样品RNA比较充裕,同时感觉本产品的成本偏高时,可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应,这样可以很好地节省本产品。
    • 如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。

  • 连接反应:25℃,孵育60min。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。
  • 终止反应:65℃,孵育15min。

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