T4 RNA连接酶II(截短型，R55K和K227Q突变)，英文名称T4 RNA Ligase II,truncated KQ，简称T4 Rnl2tr KQ，是T4 RNA连接酶II截短型的R55K和K227Q双点突变体，即在T4 RNA连接酶II截短型(以下简称T4 Rnl2tr)的基础上将227位的赖氨酸和55位的精氨酸分别突变为谷氨酰胺和赖氨酸，K227Q突变后大大降低了该酶所含有的轻微的从5'预腺苷酰化的DNA接头(AppDNA)将腺苷基团转移到RNA 5'磷酸基团同时形成5'磷酸化DNA接头(pDNA)的活性，从而减少了T4 Rnl2tr导致的RNA非特异性连接(RNA串联或自连成环)，但K227Q突变后边的连接酶活性有显著下降。在K227Q突变基础上进一步突变R55K后，酶的连接活性提升到了与野生型的连接活性相似的状态。
T4 Rnl2tr KQ与T4 Rnl2tr具有类似的连接ssRNA和AppDNA的效果，但T4 Rnl2tr能够使AppDNA去腺苷酰化，形成pDNA，而T4 Rnl2tr KQ对AppDNA不具有去腺苷酰化活性。
本制品常用于microRNA (miRNA)等3’端为羟基的单链RNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3'羟基端添加5'端预腺苷酰化的DNA或RNA接头。
本制品只能利用5'端预腺苷酰化的单链DNA或RNA作为3’端接头，因此可以大大降低连接反应的背景，通常是小RNA等建库时的优先选择。T4 Rnl2tr KQ连接时不需要ATP，但需要5'端预腺苷酰化(也称预腺苷化、腺苷酰化或腺苷化)底物。即使在有ATP存在的情况下，T4 Rnl2tr KQ也不能催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。而T4 RNA Ligase I可以在ATP存在的情况下，催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。因此T4 Rnl2tr KQ特别适用于small RNA library的制备，不管是进行miRNA的测序还是进行directional mRNA-Seq，该酶都可以提高建库的质量，并有效降低连接反应的背景。
- 5'末端预腺苷酰化的单链DNA或者RNA与单链RNA的3'羟基末端连接；
- cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和小RNA；
- 链特异性的cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和RNA；
- 二代测序中，miRNA文库构建中RNA的3'末端与接头之间的连接；
- cDNA文库的构建以进行小RNA转录组分析。
大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因为包含R55K和K227Q双突变的T4嗜菌体T4 RNA ligase 2 N端1-249位的氨基酸。
200单位定义为20μL反应体积中，25℃条件下，1小时内将31-mer RNA的80%连接到17-mer DNA的预腺苷化端所需的酶量。
| 组分 | 5kU | 20kU | 100kU |
| T4 Rnl2tr KQ(200U/μL) | 25μL | 100μL | 500μL |
| 10×T4 KQ Buffer | 75μL | 300μL | 1.5mL |
| PEG8000 (50%,RNase-free) | 400μL | 1.5mL | 7.5mL |
保存：-20℃，有效期1年。
10mM Tris-HCl (pH7.5),100mM NaCl,0.1mM EDTA,0.1mM DTT,50% (v/v) Glycerol.
无DNA内切酶和外切酶活性，无RNA酶活性，无蛋白酶活性。
65℃加热20分钟可使T4 RNA Ligase 2,truncated KQ失活，或加入蛋白酶K或EDTA也可以抑制其活性。
- 本制品提供的试剂均用不含DNA酶和RNA酶的水配制，可直接用于3'端为羟基的单链RNA和5'端腺苷酰化的DNA或RNA之间的连接反应。
- 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase抑制剂、DEPC水(货号：YT528)等。
- 使用本制品连接ssRNA和AppDNA时，建议使用的PEG8000的浓度为10%～30%，适当提高PEG8000的浓度，会显著提高T4 Rnl2tr KQ的催化的连接效率，而不改变其反应特性。
- T4 Rnl2tr KQ催化连接AppDNA和ssRNA的效果请参见图1。
图1.本制品和N公司的同类产品催化连接AppDNA和ssRNA的效果图。使用本制品或国外N公司的T4 Rnl2tr KQ，在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或国外N公司的竞品，25℃孵育60分钟进行连接反应，反应完毕后立即取样在65℃孵育20分钟终止反应，加入变性上样缓冲液，在95℃孵育5分钟后放至冰浴中，随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的催化效果。 - 百奥莱博的T4 Rnl2tr KQ与T4 Rnl2tr对腺苷酰化DNA (AppDNA)的去腺苷酰化效果请参考图2。
图2.百奥莱博的T4 Rnl2tr KQ与T4 Rnl2tr对腺苷酰化DNA (AppDNA)的去腺苷酰化活性比较效果图。在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或T4 Rnl2tr，25℃孵育60分钟进行连接反应，反应完毕后立即取样在65℃孵育20分钟终止反应，加入变性上样缓冲液，在95℃孵育5分钟后放至冰浴中，随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，T4 Rnl2tr KQ与T4 Rnl2tr的相比，具有类似的连接效果但是T4 Rnl2tr KQ对AppDNA没有去腺苷酰化活性，而T4 Rnl2tr对AppDNA具有去腺苷酰化形成少量pDNA的活性。
- 用于连接5'端腺苷酰化并且3'端不是羟基的(例如为氨基)单链DNA (AppDNA-NH2)和3'端为羟基的单链RNA (ssRNA)的使用说明具体如下。请提前准备好待连接的样品、RNase抑制剂以及接头，推荐使用通用型miRNA克隆接头(5'腺苷化、3'封闭)或自备的适当接头。
- 参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
成分 用量 终浓度 ssRNA xμL 0.5 or 1μM DEPC-treated Water (4-x-y)μL - 通用型miRNA克隆接头 yμL 1 or 0.5 or 2 or 1μM PEG8000 (50%,RNase-Free) 12μL 30% 10×T4 KQ Buffer 2μL 1× RNase抑制剂(40U/μL) 1μL 2U/μL T4 Rnl2tr KQ(200U/μL) 1μL 10U/μL 总体积 20μL - - 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase-free的。推荐在连接体系中添加RNase抑制剂，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试发现在严格操作的情况下，不加RNase抑制剂也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 进行连接反应时，如果样品RNA比较珍贵，希望充分被连接，可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接；如果样品RNA比较充裕，同时感觉接头的成本偏高时，可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应，这样可以很好地节省接头。ssRNA的用量可以根据实际的样品量进行适当调节，相应的接头的用量也按照比例进行适当调整即可。
- 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase-free的。推荐在连接体系中添加RNase抑制剂，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试发现在严格操作的情况下，不加RNase抑制剂也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
- 连接反应：25℃，孵育60分钟。
- 为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
- 终止反应：65℃，孵育20分钟。
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