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本制品是一种用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的RNA片段，最后通过PCR、qPCR或NGS等方法来检测免疫沉淀所获得的RNA片段的试剂盒。通常用于检测特定的RNA结合蛋白是否和预期的特定RNA在同一复合物中，或检测特定的RNA结合蛋白和哪些RNA结合。

组分	规格
Protein A/G Agarose	700μL
Lysis Buffer	10mL
NT2 Wash Buffer	250mL
Elution Buffer	3mL
RNase Inhibitor(40U/μL)	30μL
500mM DTT	20μL
100mM PMSF	20μL

保存：Protein A/G Agarose 4℃保存，其它组分-20℃保存，有效期1年。

• 操作过程要严格保证无RNase污染。请戴上口罩和手套操作，尽量防止人体表面的RNase污染样品。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒或耗材呼气或说话，以防RNase污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌、仪器设备表面或其它接触面上的RNase。
  
• 所用试剂和耗材都要求是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。
  
• 为确保RNA与特异性目标蛋白的结合，RIP实验中所使用的样本尽量保证为新鲜制备。
  
• Protein A/G Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。
  
• 为确保在RIP操作中RNA和蛋白质不被降解，需在使用说明中的标注之处加入相对应的RNase Inhibitor和PMSF。所有步骤尽量在冰上，以降低可能的RNase活性。
  
• 洗涤Protein A/G Agarose时小心吸除上清，宁可留下少量上清也不吸掉Protein A/G Agarose，背景较高时，可增加洗涤次数。
  
• 用于RIP检测的抗体，可先通过Western验证抗体是否可以应用于IP检测，然后再进行RIP实验。推荐使用RIP检测阳性对照试剂盒进行RIP体系的验证。
  
• 本试剂盒未提供阴性对照抗体IgG，需要向我公司单独订购与特异性目的蛋白抗体相对应种属的IgG，如兔IgG、人IgG、山羊IgG、小鼠IgG、大鼠IgG和驴IgG。

通常一次RIP反应(即使用一种抗体进行一次免疫沉淀)需要50～200万个细胞，所需Lysis Buffer 100～400μL，所需细胞量取决于目标RNA结合蛋白的表达丰度和所结合的RNA的丰度。用户可根据所研究的RNA结合蛋白和RNA靶标的丰度的不同，调整RIP实验所使用的细胞量及对应的Lysis Buffer用量。完整的RIP一般包括阴性对照IgG组、阳性对照组和目的蛋白组。本使用说明以一次RIP反应需要使用150万个细胞，所需Lysis Buffer 300μL为例。

• 洗涤Protein A/G Agarose：
  由于Protein A/G Agarose储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
  
  • 用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose，按照每300μL样品需30μL Protein A/G Agarose悬浊液，取适量Protein A/G Agarose至一洁净离心管中，加入1mL NT2 Wash Buffer。
    
  • 用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose。4℃，约1000×g离心1分钟，去除上清。共重复洗涤三次。
• Protein A/G Agarose与抗体预结合：
  
  • 按照每30μL Protein A/G Agarose悬浊液需100μL NT2 Wash Buffer的量，取适量NT2 Wash Buffer加入到洗涤后的Protein A/G Agarose中，适当重悬。
    
  • 根据实验设计，加入适量一抗(目的蛋白特异性抗体、阳性对照抗体或阴性对照IgG)，室温孵育30分钟或4℃摇床孵育1～4小时。
    
    • 高质量的抗体是保证RIP实验成功的关键因素，抗体的用量与抗体的纯度和效价、目的蛋白的丰度等有关。
    • 目的蛋白特异性抗体需自备，用量可以参考相应抗体的说明书。如果抗体的说明书中未给出用于RIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例，通常用量为1～5μg。
    • 阴性对照IgG加入量应当和目的蛋白特异性抗体加入量保持一致。
• 样品的制备：
  
  • 对于贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次；对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次。如需细胞计数，可在平行孔或皿中加入胰酶消化细胞或用细胞刮刮离细胞后进行细胞计数。
    
  • 一次RIP反应按照每150万个细胞加入300μL Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer。用移液器吹打数下，使Lysis Buffer和细胞充分接触以有效裂解细胞。
    
    • Lysis Buffer中需加入终浓度为1mM的DTT、100U/mL的RNase Inhibitor和0.2mM的PMSF。例如配制1mL Lysis Buffer，需同时向Lysis Buffer中加入2μL DTT(500mM)、2.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和2μL PMSF(100mM)。
  • 在冰浴上孵育5～15分钟，以充分裂解细胞。
    
  • 充分裂解后(对于贴壁细胞，如有必要可以用细胞刮刮离并收集细胞)，4℃，14000×g离心10分钟，取上清即为制备好的细胞样品裂解液。取出30μL (一次RIP反应的10%裂解液)样品作为Input用于后续检测。Input须-80℃保存。
    
  • 对于组织样品，通常按照15～30mg组织加入300μL Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，使用组织研磨仪或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4℃，14000×g离心10分钟，取上清即为制备好的组织样品裂解液。取出30μL (一次RIP反应的10%裂解液)样品作为Input用于后续检测。Input须-80℃保存。
    
    • 本步骤加入的Lysis Buffer同步骤3b，也需要在Lysis Buffer中需加入终浓度为1mM的DTT、100U/mL的RNase Inhibitor和0.2mM的PMSF。
• 免疫沉淀(IP)：
  
  • 步骤2中Protein A/G Agarose与抗体预结合后，4℃，约1000×g离心1分钟，去除预结合完毕Protein A/G Agarose的上清。
    
  • 取270μL细胞或组织样品裂解液，加入到抗体预结合Protein A/G Agarose中，颠倒混匀后，4℃摇床孵育4小时，也可以根据实际情况孵育更长时间或过夜。
    
    • 根据测试，样品孵育的时间越长，免疫沉淀的效果可能会更好，但也存在RNA降解的风险。一般建议4℃摇床孵育4小时。
    • 也可先将目的蛋白特异性抗体或阴性对照IgG与样品4℃摇床孵育4小时或过夜后，再加入30μL Protein A/G Agarose悬浊液室温孵育30分钟。
• 洗脱：
  
  • 4℃，约1000×g离心1分钟，去除上清。
    
  • 加入1mL的NT2 Wash Buffer，用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose，4℃，约1000×g离心1分钟，共重复洗涤四次，最后弃上清。
    
  • 加入100μL Elution Buffer，混悬均匀后，55℃孵育30分钟。
• RNA纯化：参考柱式动物RNA提取试剂盒，将Elution Buffer与Protein A/G Agarose的混合液与RNA提取试剂盒的结合液混合，进行过柱纯化RNA。步骤3d中Input组(30μL)用RNase-free Water补足体积至100μL，与其它样品体积保持一致，同时进行RNA纯化。纯化好的RNA可以立即进行后续实验或-80℃保存。RNase-free Water推荐使用无菌无酶超纯水。
  
  • 本实验对DNA残留较敏感，如有必要可以在纯化的过程中需按柱式动物RNA提取试剂盒中的建议添加DNase I去除DNA。
• RNA分析或验证：如果RBP的结合靶标未知，或者探索新的结合靶标，可以通过高通量测序来检测和分析结合的RNA。如果已知或有候选的RBP的结合RNA，RNA的分析可以通过设计特异性引物序列，使用qRT-PCR分析验证。
  
  • 反转录可以酌情使用具有Oligo(dT)、Random primers或特定引物。Oligo(dT)适合用于带有Poly(A)尾的RNA的反转录，Random primers适合用于任何长链RNA的反转录，小RNA的反转录需要使用专门适合小RNA的qRT-PCR定量方法。推荐使用cDNA第一链合成试剂盒。
    
    • 由于蛋白结合RNA的量比较低，一步法的qRT-PCR试剂盒的效果可能会欠佳，推荐使用两步法进行qRT-PCR检测，即先进行反转录，再进行qPCR。
  • qPCR检测推荐参考2×ByFast SYBR Green qPCR Mix(YTB3081/YTB3082/YTB3083/YTB4060/YTB4060)，注意引物退火温度，建议根据引物Tm值调整退火温度，如果希望提高反应特异性，可提高退火温度。
    
  • qPCR数据处理：根据2-△Ct和2-△△Ct公式计算RIP中目标RNA占Input中RNA的比例(%Input)和目标基因相当于阴性对照的富集倍数(Fold enrichment)：
    ΔCt[RIP]=Ct[RIP]–(Ct[Input]–Log2(Input Dilution Factor))，Input Dilution Factor为Input组稀释倍数，即若最初保留的Input为30μL (一次RIP反应的10%蛋白裂解液)样品，则稀释倍数为10。
    %Input = 2(-ΔCt[RIP])
    ΔΔCt[RIP/IgG]= Ct[RIP]–Ct[IgG]
    RIP Fold enrichment＝2(-ΔΔCt[RIP/IgG])。
    举例：经qPCR测定，RIP阳性对照组(HuR)的Ct值为22.6、阴性对照IgG组的Ct值为29.7、Input组的Ct值为19.3，Input稀释倍数为10。
    则ΔCt[HuR]＝Ct[HuR]–(Ct[Input]–Log2(Input Dilution Factor))＝22.6-(19.3- Log210)＝6.62
    % Input(HuR)＝2(-ΔCt[HuR])＝2-6.62=1%
    ΔCt[IgG]=Ct[IgG]–(Ct[Input]–Log2(Input Dilution Factor))＝29.7-(19.3- Log210)＝13.72
    % Input (IgG)＝2(-ΔCt[HuR])＝2-13.72＝0.0074%
    ΔΔCt[HuR/IgG]＝22.6-29.7＝-7.10
    Fold Enrichment of RNA (HuR/IgG)＝2(-ΔΔCt[HuR/IgG])＝2(-(-7.10))＝137.2

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