产品货号：
SY0798
中文名称：
His标签蛋白纯化柱(1mL)
英文名称：
Ni-NTA 6FF Chromatography Column,1ml
产品规格：
1mL|5×1mL
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种以Ni-NTA Agarose Resin 6FF为填料的中压预装柱，该预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如AKTA等，方便客户用于纯化His-tag蛋白。
Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体，螯合镍离子(Ni2+)后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性(该基质可以耐受最高0.3 MPa的压力)，该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。
基质：高度交联的6%琼脂糖凝胶
粒径：45～165μm
载量：＞40mg 6×His-tagged protein/mL基质
耐压：0.3 Mpa，3 bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸：0.7×2.5cm(1mL)
保存：4℃，有效期2年。
- 建议纯化所用缓冲液和蛋白溶液经0.22μm或0.45μm滤膜过滤后上柱使用。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、纯化流程
- 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。 - 样品准备
- 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达蛋白为例)
- 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
- 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM)，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
- 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/mL。
注：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。 - 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高，可考虑加入10μg/mL RNase A和5μg/mL DNase I)，混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
- 收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20～30min。取上清，0.22μm/0.45μm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。
- 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
- 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
注：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。 - 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
- 将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
- 按照菌体：裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
- 将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20～30min，去上清。可重复步骤b和c一次。
- 按照菌体：裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
- 变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
- 将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
- 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达蛋白为例)
- 样品纯化(以AKTA使用为例)
- 将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，再折断下口，将预装柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
- 3～5倍柱体积去离子水冲洗出存储缓冲液。
- 至少5倍柱体积的Lysis Buffer平衡色谱柱。推荐流速为1mL/min。
- 利用泵或注射器上样。
注：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大的反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。 - Wash Buffer平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10～15个柱体积)。
注：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。 - Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
- 建议用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，置于4℃保存。
- 将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，再折断下口，将预装柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
- SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
二、在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(＞0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place，CIP)。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
- 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5～10个柱体积，接触时间为15～20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1～0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。 - 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl溶液接触10～15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。
三、填料再生
当填料使用过程中发现反压过高(＞0.5 Mpa)，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。按照下面操作流程进行：
- 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
- 使用5倍柱体积100mM EDTA(pH8.0)剥落镍离子；
- 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
- 使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10～15min；
- 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
- 使用3～5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍；
- 去离子水清洗10倍柱体积。
附表1：可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
| 缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
| Lysis Buffer(pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | NaH2PO4·2H2O→7.8g NaCl→17.54g Imidazole→0.68g |
| Wash Buffer(pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl l20mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | NaH2PO4·2H2O→7.8g NaCl→17.54g Imidazole→1.36g |
| Elution Buffer(pH8.0) | 50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | NaH2PO4·2H2O→7.8g NaCl→17.54g Imidazole→17.0g |
附表2：包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
| 缓冲液名称 | 配方 | 配制1L溶液所需各种试剂量 |
| Lysis Buffer，pH8.0 | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至8.0，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | Urea→480.5g NaH2PO4·2H2O→15.6g Tris→15.76g |
| Wash Buffer，pH6.3 | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至6.3，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | Urea→480.5g NaH2PO4·2H2O→15.6g Tris→15.76g |
| Elution Buffer，pH4.5 | 8M Urea 100mM NaH2PO4 100mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至4.5，0.22μm或0.45μm过滤除菌 | Urea→480.5g NaH2PO4·2H2O→15.6g Tris→15.76g |
附表3：Ni-NTA Agarose Resin 6FF试剂耐受情况
| 试剂种类 | 浓度 |
| 还原剂 | 5mM DTE 0.5～1mM DTT 20mM β-mercaptoethano l5mM TCEP 10mM reduced glutathione |
| 变性剂 | 8M urea 6M Gua-HCl |
| 去污剂 | 2% Triton X-100(nonionic) 2% Tween20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) |
| 其他类 | 500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate |
| 缓冲液 | 50mM sodium phosphate，pH7.4 100mM Tris-HCl，pH7.4 100mM Tris-acetate，pH7.4 100mM HEPES，pH7.4 100mM MOPS，pH7.4 100mM sodium acetate，pH7.4 |
附表4：问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
| 柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 裂解液中可能含微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22μm或0.45μm)过滤，或离心去除。 |
| 样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNase I(终浓度为5μg/mL)，Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10～15min | ||
| 样品太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高，降低操作流速。 | |
| 洗脱组分中无目的蛋白 | 蛋白可能是包涵体 | 可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式 |
| 表达量太低 | 优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系 | |
| 目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来 | 提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度 | |
| 目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来 | 降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度 | |
| 使用10～100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白 | ||
| 蛋白降解 | 菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂 | |
| 在4℃下进行纯化操作 | ||
| 洗脱组分不纯(含多种蛋白) | 洗杂不彻底 | 增加Wash Buffer体积 |
| 样品中含有其他His标签蛋白 | 通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换，疏水等)进一步纯化洗脱组分。 | |
| 填料颜色变浅或变成白色 | 镍离子脱落或者剥离 | 按照填料再生的操作重新挂镍离子 |
| 填料呈现褐色 | 缓冲液中含有DTT等还原剂 | 参考附3适当降低还原剂DTT的浓度，或改用巯基乙醇 |
| 上样过程中蛋白发生沉淀 | 操作温度太低 | 室温下进行上样 |
| 蛋白发生聚集 | 在样品和所有缓冲液中添加稳定剂，如0.1% Triton X-100或Tween-20 |
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