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McrBC是一种核酸内切酶，无论甲基胞嘧啶^*是在DNA的一侧链上还是在对侧链上，McrBC都能切割。对未甲基化的DNA，McrBC无作用。DNA上McrBC的识别位点由两个(G/A)mC形式的半位点组成，这两个半位点之间的距离可以达到3kb，但是最佳距离为55～103bp。McrBC的切割需要GTP，当存在不可水解的GTP类似物时，该酶可以特异地结合到甲基化DNA上，但不能进行切割。McrBC作用于一对PumCG序列元件，以此检测高比例甲基化的CpGs，但是不能识别内部胞嘧啶甲基化了的HpaII/MspI位点(CCGG)。
注^*：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或者N4-甲基胞嘧啶。

5'…Pu^mC(N_40-3000)Pu^mC…3'

• 测定CpG二核苷酸的甲基化状态。
  
• 测定胞嘧啶甲基化的DNA。

图1．McrBC一起温育的人类和果蝇基因组DNA。在脊椎动物中估计有60～90%的CpGs是被甲基化的，而果蝇DNA中甲基化的CpGs非常稀少（大约12.5kb的DNA中仅出现一个甲基胞嘧啶）。
泳道1：人类DNA；
泳道2：与McrBC一起温育的人类DNA；
泳道3：果蝇DNA；
泳道4：与McrBC一起温育的果蝇DNA；
泳道M：BstEII消化的λDNA。


两种组成蛋白分别纯化自含有编码McrB和McrC质粒的E.coli K-12菌株。


1单位指在50μL反应体系中，37℃条件下，1小时切割0.5μg含有多个McrBC酶切位点的质粒所需要的酶量。

组分	500U	2500U
McrBC(10U/μL)	50μL	250μL
10×BalbBuffer 2	1.25mL	1.25mL
重组白蛋白(20mg/mL)	600μL	600μL
对照质粒DNA(100μg/mL)	20μL	20μL
GTP(100mM)	50μL	3×50μL

保存：-20℃


10mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，500μg/ml BSA，50% Glycerol，pH7.4@25℃。


1×BalbBuffer 2，1mM GTP，200μg/ml重组白蛋白，37℃温育。


1×BalbBuffer 2：
50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，pH7.9@25℃。


McrBC限制性内切酶在不同缓冲液中的活力表现如下：

缓冲液	活力
BalbBuffer 1	50%
BalbBuffer 2	100%
BalbBuffer 3	10%
BalbBuffer 4	75%

65℃加热20分钟。

• McrBC在每对半位点之间切割一次，切割位点靠近某一个半位点，但是通常距最近的甲基化碱基大约30bp。因此，当DNA中存在多个McrBC半位点时（例如胞嘧啶甲基化基因组DNA），识别序列的可变性导致位点重叠，产生弥散状而不是细窄的条带。
  
• GTP不稳定，建议分装保存。
  
• 本产品提供的对照质粒DNA为4.3kb的线性甲基化质粒，可被McrBC切成几个700bp～2.3kb的片段。

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