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本制品是基于生物素-SA磁珠法开发的用于蛋白质-DNA复合物Pull-Down实验的试剂盒。

• 本制品提供试剂足够进行30次蛋白质-DNA Pull-Down实验。
  
• 磁珠经过优化能更高效的结合DNA及其结合蛋白。
  
• 兼容性强，收集的产物可以进行后续多种实验。
  
• 收集到的DNA保持原有的生物活性。

1. 用自选方法获得带生物素标记的DNA探针，如较短可直接合成，如较长可以合成带生物素的引物进行扩增获得。
   
2. 取2μL DNA检测浓度，取1～2μL DNA进行2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和长度；符合要求的DNA置于-20℃保存或直接用于后续实验。

3. 实验组和对照组一共取2E7~4E7个细胞，用预冷的PBS（DNase-free）清洗细胞2～3次，每次4℃ 500×g离心5min收集沉淀，去除培养基成分。
   
4. 将样本置于冰上，加入0.6mL预冷的Pull-Down专用裂解液、6μL Pull-Down专用蛋白酶抑制剂和3μL Pull-Down专用DNase抑制剂，吹打混匀。
   
5. 为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清，如果无超声条件，也可以置于冰上裂解30min，间隔手动混匀。
   
6. 4℃ 12000×g离心15min，收集上清至新的无DNase离心管中。
   
7. 取30μL作为input，剩余上清平分为两份用于DNA pull-down实验，置于冰上备用或-80℃保存。

8. 采用预冷的PBS（DNase-free）清洗新鲜组织2～3次，彻底去除血液等成分；如果样本为冷冻组织，在取样时也需要进行清洗操作。
   
9. 实验组和对照组共取0.2～0.4g干净组织，用液氮在研钵中充分研磨，转移粉末至预冷的、新的无DNase离心管中。
   
10. 同7～9步。注：当样本不能完全裂解时（溶液很浑浊），可以增加裂解缓冲液或改善超声条件继续裂解。超声条件因样本类型和超声设备而异，应提前摸索好合适的条件。如果样本中目标蛋白或DNA丰度较低，或结合物间的结合较弱，可以增加初始样本量，同时等比例增加裂解缓冲液和酶抑制剂的用量，但总孵育体积最大不超过离心管体积的2/3，体积过大可以更换大规格离心管。

11. 将Pull-Down专用磁珠上下颠倒混匀，取实验组和对照组一共所需的80μL磁珠到新的无DNase离心管中。
    
12. 加入1mL NT2缓冲液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1min并弃上清。
    
13. 重复上步操作一次。
    
14. 加入400μL NT2缓冲液，上下颠倒重悬磁珠，然后将磁珠平分为两组，每组各约200μL，转移到新的无DNase离心管中，记为实验组和对照组。

15. 为了防止实验过程中的蛋白和DNA降解，需要向漂洗液中添加蛋白酶抑制剂和DNase抑制剂。在10mL离心管中加入实验组和对照组总共所需的5mL Pull-Down专用洗涤液、25μL Pull-Down专用蛋白酶抑制剂和2.5μL Pull-Down专用DNase抑制剂，混合均匀，冰上保存，现配现用。如果有多组样本，请按照实际使用量配制。

16. 取实验组和对照组DNA探针各3μg，95℃变性3min，冰浴1min，短暂离心甩下管壁液体，向管中加入50μL Pull-Down专用DNA折叠缓冲液，室温放置30min。
    
17. 将DNA探针分别加入对应步骤四制备的磁珠中，混匀仪上室温孵育30min。
    
18. 放磁力架上静置1min并弃上清。
    
19. 每组加入500μL步骤五准备的漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1min并弃上清。
    
20. 重复上步操作一次。
    
21. 加入相应组别的样本裂解液，混匀仪上4℃孵育2~4h。
    
22. 放磁力架上静置1min并弃上清。
    
23. 每组加入500μL漂洗液，颠倒混匀30次，放磁力架上静置1min弃上清。
    
24. 重复上步漂洗操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

25. 向磁珠中加入50μL Pull-Down专用洗脱液，涡旋震荡20 s，混匀仪上室温洗脱10～15min；涡旋震荡20 s，1000×g离心20 s；放磁力架上静置1min，收集上清至新的离心管，-80℃保存。该洗脱产物适用于后期各种检测，例如质谱、SDS-PAGE或Western-blot等。