产品货号：
KL230802
中文名称：
双修饰RNA体外合成试剂盒
英文名称：
Real-Time Double Modified T7 in vitro Transcription Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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用体外转录方法制备的RNA是RNA药物和RNA疫苗的重要原料，但研究发现如果在体外转录时用5mCTP（5-methylcytosin-5'-triphosphate）和三磷酸假尿苷（N1-methyl-pseudouridine-5'-triphosphate）分别替代CTP和UTP，得到的修饰RNA翻译效果提高40多倍，免疫性也大为降低。为此本公司在常规T7体外转录试剂的基础上，升级开发了本制品。
- 用5mC-CTP代替CTP，用N1-Me-pUTP代替UTP，并且分开而不是以混合液的方式提供，方便用户制备单一种修饰或者双重修饰的RNA。
- 即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可。
- 提供体外转录专用荧光染料，加入到体系中可以实时监控反应的进行，便于优化条件。实验结束后不需要浪费宝贵的样本进行电泳。如果担心染料对后续实验有影响，也可以不加。
- 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
- 可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
- 产品配方经过精心优化，1μg质粒DNA模版可以在3小时内合成大约30μg修饰RNA（具体跟模板DNA序列，长度，纯度等相关）。
- 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
| 组分 | 规格 |
| 2×双修饰T7转录预配液 | 0.5mL 0.5mL绿盖管 |
| 体外转录专用荧光染料 | 50μL 0.5mL棕色盖 |
| T7 RNA聚合酶-RI混合液 | 50μL 0.5mL红盖管 |
| RNase-free水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒足够50次20μL体系的修饰碱基体外转录实验。
Tris饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。
一、制备DNA模板
本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考。PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点：
- 必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
- 需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列（5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3'）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
- 需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3'突出。如果是3'突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
- 必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须反复酚-氯仿抽提去除残留的RNase，然后再乙醇沉淀质粒DNA。
二、体外转录反应
- 按下表设置体外转录反应：
成分 样品管 阴性对照管 DNA模板 50ng PCR片段或1μg线状质粒 不加 2×双修饰T7转录预配液 10μL 10μL 体外转录专用荧光染料 1μL 1μL T7 RNA聚合酶-RI混合液 1μL 1μL RNase-free水 至20μL 至20μL - 此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。修饰T7转录预配液已经含有修饰核苷酸。
- 在荧光定量PCR上37℃保温4小时。每分钟采集一次SYBR通道的荧光信号。如果没有加体外转录专用荧光染料，可以不采集荧光信号。不一定要跑慢4个小时，可以在荧光信号到达平台期后停止反应。
- 如果没有加荧光染料，反应结束后需要取1～3μL电泳，此时最好用DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA（由于合成的RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰，而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
- 如需去除DNA模板，需要另购线状DNA清除剂。最好不要实用DNase法。
- 再用自备的RNA纯化试剂盒纯化修饰RNA。
- 最后用自备的单链RNA定量试剂盒测定修饰RNA的浓度。
- 将纯化的RNA放-80℃保存。
- 没有RNA产物。
最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳，再检测其是否有污染。 - RNA产量低。
最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。 - RNA长度比预期的短。
可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒（启动子也必须改成SP6启动子）。 - RNA长度比预计的长。
T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。 - 5'单磷酸还是三磷酸。
如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。 - 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA。
需加入带帽NTP类似物即可，但由于竞争抑制，效果不高。另一方法是使用本公司的加帽试剂盒。
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