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WHO规定生物制品中不能含有逆转录病毒污染，逆转录病毒种类繁多，故一般通过检测逆转录酶活性来间接检测逆转录病毒存在与否。药典规定的检测逆转录酶的方法是PERT法（Product-Enhanced Reverse Transcription），其原理是用待测样品代替逆转录酶进行RT-PCR，通过标准品制备的标准曲线计算出样品中是否存在逆转录酶以及其浓度，进而推算出样本是否含有逆转录病毒及其浓度。PERT法根据酶活性检测，普适性广，可检测出oncovirus、lentivirus和spumavirus等几大类已知和未知的逆转录病毒。但常规PERT法是两步法RT-PCR加电泳检测，操作繁琐，误差大，不适合高通量操作。为克服此缺点，本公司开发了一管式实时PERT试剂盒。

• 即开即用，用户只需要提供待测样品。
  
• 操作简单快捷，一步加样操作，变异系数小，适合高通量操作。
  
• 实时荧光检测，一管式反应，避免样本交差污染。
  
• 灵敏性高，最低可以检测到几十个逆转录酶分子的活性。
  
• 背景低，本制品所用的DNA聚合酶不含背景逆转录酶活性，使用的RNA模板在生命周期中无DNA环节，不会自带污染源。
  
• 起始样本可以是细胞培养上清液、细胞裂解液和纯化的逆转录酶溶液，可以检测到里面所含有的逆转录酶活性，并由此判断是否有逆转录病毒的存在。
  
• 含逆转录酶阳性对照，便于制备标准曲线和排除假阴性实验。
  
• 定量检测的线性范围至少为6个数量级。
  
• 本制品只能用于科研，包括生物制品和细胞库等质检环节。

1. 细胞培养上清液制备：收集上清液，11000g离心10分钟，0.45μm滤膜过滤，100000g超速离心60分钟得病毒颗粒。用PERT样本稀释液重悬病毒颗粒后放冰上待用，此为待测样本。每次PERT实验可以用1～5μL待测样本。
   
2. 细胞裂解液制备：将洗涤后的10⁶个细胞沉淀重悬在200μL PERT样本稀释液中，冰上放置20分钟裂解细胞。用自备的试剂测定蛋白浓度，每次PERT实验需要用0.1～1μg蛋白样本。

3. 标记10个离心管，分别为1、2、3、……8、9、10。
   
4. 用带芯枪头在10个管中分别加入45μL PERT样本稀释液。
   
5. 在1号管中加入5μL MMLV逆转录酶（200U/μL），轻柔吹打1分钟得1号稀释液，放冰上待用。此为原液的10倍稀释液，浓度为20U/μL。
   
6. 换枪头，在2号管中加入5μL 1号稀释液，轻柔吹打1分钟得2号稀释液。放冰上待用。此为原液的10²倍稀释液，2U/μL。
   
7. 重复上面的操作直到得到10个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。一般第一次实验时先选用3～8号稀释液共6个样本，然后根据结果再决定后续实验是用更低还是更高稀释度的样本。上述稀释的酶标准品在-20℃至少可保存3个月。

8. 首次使用本制品时，请在PERT引物-探针混合物干粉管中，加入150μL超纯水，涡旋震荡30秒混匀，得PERT引物-探针混合液，放冰上待用。没用完的混合液需要放-20℃保存。
   
9. 首次使用本制品时，请在PERT RNA模板干粉管中加入100μL超纯水，涡旋震荡30秒混匀后放冰上待用。没用完的模板溶液需放-80℃保存。
   
10. 如果有N个待测样本，做6个点的标准曲线，则标记N+7个反应管，其中N个管用于N个待测样本，多出的1个管用于无样本阴性对照，6个用于制作标准曲线（也相当于阳性对照）。按下表加入各成分：
    

    成分	无模板对照	无样本对照	N个样品管	6个标曲管
    PERT引物-探针混合液	3μL	3μL	各3μL	各3μL
    PERT RNA模板溶液	-	2μL	各2μL	各2μL
    PERT样本稀释液	2μL	2μL	-	-
    超纯水	5μL	3μL	各3μL	各3μL
    N个待测样本	-	-	各2μL	-
    第8步所得MMLV标准品 的3～8号稀释液	-	-	-	各2μL
    2×PERT MasterMix	各10μL	10μL	10μL	各10μL

    • 如果样本含DNA聚合酶，由于部分DNA聚合酶也有微弱的RT活性，故无逆转录酶的样本也可能出现阳性结果。用户可以在每管中加入2μL DNA聚合酶RT活性抑制剂予以屏蔽（同时少加2μL超纯水）。该产品需另购。
11. 在PCR仪上进行如下反应：42℃ 10分钟，95℃ 5分钟，（95℃15秒、52℃ 30秒、72℃ 30秒）循环40次循环。
    • 42℃是本试剂盒提供的MMLV逆转录酶标准品的最适温度，用户可根据待测逆转录酶的最适温度调整。

12. 实验有效性判断：如果无模板对照或无样本对照出现了Ct值并且荧光信号有标准的倒S扩增曲线，则说明试剂或环境有污染，则整个实验无效。如果所有阳性对照（标曲管）均无扩增，则说明试剂、仪器或操作有问题，则整个实验也无效。
    
    • 实验无效时需要先找到原因后再继续实验。如果实验有效，可继续后续的分析。
13. 制作标准曲线：以MMLV逆转录酶标准品的浓度（pU/μL，不是U，下同）的log值为横轴，以FAM通道的Ct值为纵轴，绘制标准曲线。
    
14. 用N个待测样品的Ct值从标准曲线上推算出其对应逆转录酶浓度的log值，再用该log值计算出其对应的逆转录酶浓度，再根据体积计算出使用的活力单位。
    
15. 如果知道所测逆转录酶的重量，则可以计算出其比活（活性单位/mg）。本制品提供的MMLV逆转录酶的比活为280,000U/mg。
    
16. 如果知道所测逆转录酶的分子量，还可以计算出每个逆转录酶分子有多少活性单位。假设测出某AMV逆转录酶样本比活为36500U/mg，由于AMV逆转录酶的分子量为158kDa，则1mg AMV逆转录酶的摩尔数为1/(1.58×10⁸)，其对应的分子数为(6.02×10²³)/(1.58×10⁸)=3.81×10¹⁵。由于1mg的活力为35600U，故每个AMV逆转录酶分子对应36500U/3.81×10¹⁵=0.96×10^-11U=9.6pU。常用的MMLV逆转录酶的分子量为78kDa，HIV-1逆转录酶分子量为117kDa。
    
17. 如果知道每个AMV病毒颗粒含多少个逆转录酶分子，可以计算出每个病毒颗粒有多少逆转录单位。根据文献，每个禽类逆转录病毒（包括AMV病毒）颗粒约含70个逆转录酶分子，每个鼠逆转录病毒颗粒和人HIV病毒颗粒约有70～80个逆转录酶分子。故每个AMV病毒颗粒有9.6×70=673pU。