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本试剂盒利用探针-RNA杂交、RNase H消化的方法来去除人/小鼠/大鼠总RNA中的细胞质rRNA（5s rRNA、5.8s rRNA、18s rRNA、28s rRNA）和线粒体rRNA（12s rRNA、16s rRNA）。rRNA去除样本适用于RNA-Seq、cDNA合成及其他RNA分析。

• 本试剂盒可有效去除人/小鼠/大鼠95%以上的rRNA。
  
• 适用于人/小鼠/大鼠（10ng～1μg）RNA样本。
  
• 适用于完整或部分降解RNA样本（如FFPE样本）。

• RNA样品与探针杂交：
  
  • 将Nuclease-free PCR管置于冰上，依次加入下列组分：
    

    成分	用量
    总RNA	10ng～1μg
    rRNA probe（H/M/R）	2μL
    5×hybridization buffer	3μL
    RNase-Free Water	至15μL

  • 按下表的程序进行杂交反应
    

    温度	时间
    95℃	2min
    95～22℃	0.1℃/sec，约12min
    22℃	5min

    
    
  • 短暂离心后，置于冰上，并立即开始下步反应。
• RNase H消化：
  
  • 将Nuclease-free PCR管置于冰上，依次加入下列组分：
    

    成分	用量
    步骤1杂交产物	15μL
    RNase H（5U/μL）	1μL
    10×RNase H Reaction Buffer	2μL
    RNase-free water	至20μL

  • 混匀后放入PCR仪，37℃孵育30min（盖子温度40℃），立即进行下步反应。
• DNase I消化：
  
  • 将Nuclease-free PCR管置于冰上，依次加入下列组分：
    

    成分	用量
    步骤2消化产物	15μL
    DNase I（1U/μL）	5μL
    10×DNase I Reaction Buffer	5μL
    RNase=free water	至50μL

  • 混匀后放入PCR仪，37℃孵育30min（盖子温度40℃）。立即进行下步反应。
• RNA beads纯化：
  
  • 涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取100μL 2×RNA Cleaner beads加入50μL步骤3反应产物PCR管中，用
    移液器吹打6次充分混匀。
    
    • 磁珠应提前从4℃取出，室温平衡30min后再使用。
  • 室温孵育5min，使RNA结合到磁珠上。
    
  • 将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心移除上清。
    
  • 保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇，漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。
    
    • 漂洗时使用的80%乙醇需要使用RNase free water新鲜配制，以防止引入RNase导致RNA降解。
  • 重复步骤d，共漂洗2次。
    
  • 保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min。
    
    • 磁珠开盖晾干时要避免过分干燥，如果磁珠出现龟裂，提示磁珠过分干燥，此时RNA的洗脱效率会降低。
  • 将样品从磁力架上取出，加入11μL RNase free water，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置5min。
    
  • 将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后，小心转移上清10μL至一个新的200μL Nuclease free PCR管中。
    
  • 得到的RNA极不稳定，建议立即进行后续实验，或置于-80℃保存。
    
    • 可用rRNA qPCR引物，以rRNA去除前后RNA为模板进行qRT-PCR检测，以判断rRNA的去除率。