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生物素-HPDP是与巯基(-SH)基团反应的膜可渗透的生物素标记试剂。巯基和生物素基团之间的二硫键可以被还原剂切割，释放出生物素基团，并以蛋白质(或肽)原始的形式再生(图1)。在用固定的抗生物素蛋白或链霉亲和素纯化目标分子，用于还原SDS-PAGE或质量分析时，使用生物素HPDP标记是非常方便的。标记的生物素化分子可以通过二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂裂解二硫键，从载体上有效地洗脱，并不是用强酸或变性剂来解离抗生物素蛋白和生物素之间的高亲和力结合作用。

生物素-HPDP的2-吡啶基二硫基基团在pH7～8与游离(还原)的巯基的反应效果最好。反应缓冲液必须不含硫醇和二硫化物还原剂，猝灭或还原时才需要2-吡啶基二硫醇。

生物素-HPDP与巯基的反应置换了吡啶-2-硫酮基团，其浓度可以通过测量343nm处的吸光度来确定(参见附加信息部分)。对于足够浓度的反应，该测量能够监测反应进程。

为了制备可用于标记的巯基(-SH)，用固定的TCEP二硫化物还原凝胶来还原肽二硫键。使用5～10mMDTT或TCEP溶液还原蛋白质二硫键，然后脱盐。请注意蛋白质(例如抗体)在完全还原其二硫键后可能会失活。可以使用SATA或2-亚氨基硫烷·HCl将巯基引入伯胺位置。

当生物素化蛋白质在溶液中时，过量的未反应的生物素通过使用脱盐柱或透析的尺寸排除容易地去除。根据下游应用，可以使用C18树脂从过量的非反应生物素试剂中纯化生物素化的肽。

中文名称	N-(6-[生物素胺]己基)- 3-(2-吡啶二硫)丙酰胺
分子量	539.78
间隔臂长度	29.2 Å
结构式

• 需要材料
  
  • 反应缓冲液：不含巯基的缓冲液，磷酸盐缓冲液PBS。在缓冲液中加入1mM EDTA有助于维持还原的巯基，直到它们有机会与HPDP-生物素反应。
    
  • 溶剂：HPDP-生物素不溶于水相缓冲液，必须先溶解在有机溶剂(二甲基亚砜DMSO或二甲基甲酰胺DMF)中再加入水相反应物中。
    
  • (可选)：用于分离标记的蛋白质与过量的未反应的HPDP-生物素：脱盐柱或透析盒。
• 材料制备
  HPDP生物素储存溶液：在1.0mL溶剂DMF中加入2.2mg HPDP-生物素，制备4mM HPDP-生物素原液。为了确保试剂完全溶解，将混合物温和加热至37℃，搅拌或超声处理。原液可以分装并冷冻储存。
  
• β-D-半乳糖苷酶(蛋白质)的生物素化
  
  • 将2mg还原的β-D-半乳糖苷酶溶解在1mL反应缓冲液中。
    
  • 向1mL蛋白质溶液中加入100 μlHPDP-生物素储备溶液(终浓度0.4mM生物素HPDP)。
    
  • 混匀，然后在室温下孵育2小时。
    
  • 用反应缓冲液或其他合适的缓冲液平衡的脱盐柱对反应混合物进行脱盐处理。

• 吡啶-2-硫酮测试监测反应
  
  • 在蛋白质样品中加入HPDP-生物素之前和之后，测量和记录蛋白质样品在343nm处的吸光度，空白样为缓冲液(例如PBS)。
    
  • 在开始标记反应后的各个时间点，测量并记录样品的343nm处的吸光度。
    
  • 计算吸光度的变化：ΔA343 =(Ave.A343T)—(Ave.A343 T0)
    
  • 使用以下公式计算生物素与蛋白质的摩尔比：
    

    ΔA	×	蛋白分子量	＝生物素/蛋白的摩尔比
    8080		蛋白浓度(mg/mL)

    注：8080是吡啶-2-硫酮在343nm处的消光系数：8.08×10³ M^-1cm^-1。
• 生物素掺入的测定
  可以使用HABA(4'-羟基偶氮苯-2-羧酸)测试方法估计生物素的掺入量。