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Biotin-BMCC是具有长间隔臂的巯基反应性生物素化试剂。马来酰亚胺活化试剂能够有效修饰含巯基的蛋白质。马来酰亚胺基团在pH6.5～7.5与游离（还原）的巯基有效反应，形成稳定的硫醚键（图1）。大多数蛋白质具有半胱氨酸残基，其硫链上硫原子通常以二硫键成对出现。还原这些二硫键获得所需的巯基，能够用马来酰亚胺活化试剂生物素化或者可使用各种改性试剂将巯基添加到蛋白分子中（参见相关产品信息）。Biotin-BMCC不能直接溶于水或水相缓冲液中，首先将其溶解在二甲基亚砜（DMSO）或其它有机溶剂中，然后以反应浓度将其稀释并加入到水相缓冲液中。

生物素是一种小的天然存在的维生素，以高亲和力结合抗亲和素蛋白和链霉亲和素蛋白。因为它的分子量相对较小，所以生物素可以与很多蛋白结合而不影响它们的生物活性。与几种生物素分子结合的抗体可以扩增信号，从而增加许多测定的灵敏度。生物素和抗生物素蛋白之间的键是快速形成的，一旦形成，不受大多数极端条件，pH，有机溶剂和其他变性剂影响。标记的蛋白质可以用含有抗生物素蛋白，抗生物素蛋白缀合的探针在ELISA，Dot blot或Western blot应用中检测。可以使用固定化或缀合产物的ELISA，Dot blot或Western blot中检测。

图1．巯基分子与BMCC-生物素的生物素化反应方案。

英文名称：(1-Biotinamido)-4-[4'-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxamido]hexane
中文名称：1-生物素酰氨基-4-[4`-(甲基马来酰胺)环己烷甲酰胺]丁烷
分子量：533.68
间隔臂：32.6 Å
纯度：＞95% on TCL
溶解度：DMSO：约4.5mg/mL(8.5mM)；DMF：少量溶解
反应pH值：酸性或中性

组分	规格
生物素标记BMCC	50mg
说明书	1份

保存：-20℃

• Biotin-BMCC对湿度敏感，将其放4℃下干燥储存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须平衡到室温。马来酰亚胺部分在水中易水解并变成无活性，因此不要制备用于储存的储备溶液，实验前配制，弃掉所有未使用，重构的试剂溶液。
  
• 蛋白分子必须具有与马来酰亚胺反应的游离的（还原的）巯基。可以用固定的TCEP二硫化物还原肽二硫键。使用5mM TCEP（1:100稀释的TCEP溶液）在室温下还原高分子量蛋白质中的二硫键，30min，然后用脱盐柱去除TCEP。请注意，蛋白质（例如抗体）可能因二硫键的完全还原而失活。选择性还原IgG铰链区中二硫键的可以用2-巯基乙胺·HCl完成。可以使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫基乙酸酯（SATA产品）或2-亚氨基四氢噻吩·HCl（Traut's Reagent）将巯基加成到蛋白分子中，修饰伯胺。
  
• 避免在偶联过程中使用含有外来巯基组分（如DTT）的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争，抑制和降低预期目标的共轭效率。马来酰亚胺基团在pH6.5～7.5主要与游离（还原）的巯基反应，形成稳定的硫醚键。如有必要，将样品透析或脱盐，转换为合适的缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）。
  
• 在pH值> 7.5时，可能与伯胺发生反应，马来酰亚胺基团可能水解。在pH=7时，相对于胺基，马来酰亚胺基团与游离巯基的反应速度约为1000倍。

用Biotin-BMCC标记蛋白的方法
用于每个反应的Biotin-BMCC的最佳用量取决于很多因素。通过调节反应中的试剂与目标蛋白的摩尔比，可以控制标记的程度。作为起始点，若蛋白质溶液>2mg/mL，使用10～30倍摩尔过量的的试剂。当标记更稀释的蛋白溶液时，可能需要更大倍数摩尔过量的试剂，才能达到相同的标记效果。小分子修饰的最佳摩尔比可能显着不同，作为参考，提供了IgG修饰的实例计算（分子量为150kDa）。

• 计算：
  
  • 计算要添加到反应体系中的10倍摩尔过量的试剂的量（以mmol为单位）
    

    mL protein	mg protein	×	mmol protein	×	10mmol Biotin Reagent	＝mmol Biotin Reagent
    	mL protein		mg protein		mmol protein

    
    注：该方程式中的值10对应于2mg/mL蛋白质样品的建议试剂摩尔倍数（过量试剂的量）。
    
  • 计算加到反应体系中的8mM Biotin Reagent Stock Solution（在步骤B.1中准备）的体积（μl）
    

    mmol Biotin Reagent	×	1,000,00μL	×	L	＝μL Biotin Reagent Stock Solution
    		L		8mmol

  
  举例说明：
  For 1mL of 2mg/mL IgG(150,000 MW) solution,~17μL of 8mM Biotin Reagent will be added.
  
  

  1mL IgG	2mg IgG	×	1mmol IgG	×	10mmol Biotin Reagent	＝0.000133mol Biotin Reagent
  	1mL IgG		150,000mg IgG		1mmol IgG

  
  

  0.000133mol Biotin Reagent	×	1,000,00μL	×	L	＝16.6μL of 8mM Biotin Reagent Stock Solution
  		L		8mmol

  
  
• Biotin标记反应
  
  • 根据A部分计算结果，将待修饰的蛋白质溶解于不含巯基的缓冲液中（pH6.5～7.5），若蛋白质已经溶解在不含巯基的缓冲液（pH6.5～7.5）中，则无需进行缓冲液更换或稀释。
    
  • 使用前向2.1mg的Biotin-BMCC中加入500μL的DMSO，制备8mM储备液。
    
  • 将适量的Biotin-BMCC（见A计算部分）加入到蛋白质溶液中并混匀。
    
  • 在冰上或室温下孵育2小时至过夜。除了一般蛋白质的降解或微生物生长的可能性外，延长反应时间一般情况下不会影响交联效率。
    
  • 此时蛋白质标记完成，虽然过量的未反应物质和水解的Biotin试剂残留在溶液中，但通常可以用标记的蛋白质进行初步测试。一旦确定蛋白质的功能正常和标记成功，为了获得蛋白质最佳的性能和稳定性，标记的蛋白质可以使用脱盐柱或透析从未反应的Biotin-BMCC中纯化。

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