牛脑源性神经生长因子ELISA试剂盒

产品货号：

ZN3100

中文名称：

牛脑源性神经生长因子ELISA试剂盒

英文名称：

Bovin brain derived neurotrophic factor ELISA Kit

产品规格：

96T

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)用于体外定量分析牛血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清中的BDNF。

背景资料

脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)成熟形式有119个氨基酸，分子量13KDa。在所有哺乳动物系中蛋白序列高度保守。和其它神经生长因子相似，其中和NGF有52%的同源性。BDNF在体液中以非共价键二聚体的形式存在，分子中有六个胱氨酸残基，可以形成三个二硫键。纤维母细胞、星型胶质细胞、各种神经元、巨核细胞/血小板、schwann细胞(损伤附近)、某些肌细胞都表达BDNF。BDNF在血浆的表达处于pg/ml水平，在血清的表达处于ng/ml水平，显然和血小板释放BDNF有关。BDNF有两种受体，一种是低亲和力NGFR，另一为Trk B。

检测原理

预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体为单克隆抗体，克隆号35928.11，经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的BDNF呈正相关。

产品组成

内容	规格	数量
预包被抗牛BDNF抗体的96孔板	96T	1板
重组牛BDNF冻干标准品	10ng/管	2管
生物素标记抗牛BDNF(100X)	100μL	1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X)	100μL	1管
样品稀释液	30mL	1瓶
抗体稀释液	12mL	1瓶
ABC稀释液	12mL	1瓶
TMB显色液	10mL	1瓶
终止液	10mL	1瓶
洗涤缓冲液(25X)	20mL	1瓶
封板膜		4张

标准规格酶标仪。
自动洗板机。
恒温箱。
系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
干净的试管和Eppendof管。
用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆：采用肝素、柠檬酸盐或EDTA抗凝，抽血后30分钟内在2～8℃离心2000×g 20分钟。为消除血小板的影响，建议在2～8℃进一步离心10000×g 10分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

高：指待测因子在20～200ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
中：指待测因子在2～20ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
低：指待测因子在31.2～2000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
特低：指待测因子≤31.2pg/ml。样品一般不做稀释，按每孔100μL样品直接加入。

BDNF标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。
试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
- 配制10000pg/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
- 配制2000pg/ml标准品：取0.2mL 10000pg/ml的标准品加入有0.8mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
- 配制1000pg/ml～31.2pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。取0.3mL 2000pg/ml的标准品加入标记1000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
  注意：已经稀释的标准品(10000pg/ml)，应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，不能反复冻融。
生物素标记抗牛BDNF抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100～200μL)。
- 按1μL生物素标记抗牛BDNF加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备：在使用前1小时内准备。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100～200μL)。
- 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
将2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于牛血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
将准备好的生物素抗牛BDNF抗体工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应25～30分钟。
注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
用酶标仪在450nm测定OD值。
有两种设定空白对照的方案：
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸
光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
TMB 37℃反应25～30分钟。
加入终止液，读数。

TMB 37℃反应25分钟。
(数据供参考，不同用户最佳显色时间会有所不同)

浓度(pg/mL)	0.0	31.2	62.5	125	250	500	1000	2000
OD值	0.019	0.045	0.084	0.168	0.348	0.794	1.740	2.432

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