本制品是一种利用荧光探针BODIPY 581/591 C11进行3D培养的细胞球或类器官中脂质过氧化检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地检测3D培养的细胞球或类器官中脂质过氧化程度的变化。通常仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中脂质过氧化的绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
- 本试剂盒组分齐全，使用方便。本试剂盒提供了LpoUp作为诱导细胞内脂质过氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5～2×，最优先的推荐终浓度为1×。同时提供了By3D BDPY 581/591 C11 Assay Buffer，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。
- 本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、MatrixBlab基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约3小时即可完成。将本试剂盒中的By3D BPPY 581/591 C11 (1000×)按照相应比例用By3D BDPY 581/591 C11 Assay Buffer配制成By3D BDPY 581/591 C11检测工作液，避光孵育3D细胞球30分钟，使用脂质过氧化阳性对照试剂LpoUp等诱导处理3D细胞球后，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
| 组分 | 200T | 1000T |
| By3D BDPY 581/591 C11 (1000×) | 20μL | 100μL |
| By3D LpoUp (500×) | 20μL | 100μL |
| By3D BDPY 581/591 C11 Assay Buffer | 20mL | 100mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- BSA和酚红对本荧光探针的检测有干扰，需避免。
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- 本试剂盒应在无菌环境中使用，否则可能会影响检测结果。
- 本试剂盒仅限用于活细胞的检测。
- 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经脂质过氧化诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。如果后续用于荧光酶标仪检测，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- BDPY 581/591 C11染色：
- By3D BDPY 581/591 C11检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D BDPY 581/591 C11检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D BDPY 581/591 C11检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL BDPY 581/591 C11检测工作液的量，用By3D BDPY 581/591 C11 Assay Buffer稀释配制适量的By3D BDPY 581/591 C11检测工作液。
样品数 10个样品 50个样品 100个样品 By3D BDPY 581/591 C11 (1000×) 1μL 5μL 10μL By3D BDPY 581/591 C11 Assay Buffer 1mL 5mL 10mL By3D BDPY 581/591 C11检测工作液 ~1mL ~5mL ~10mL - 配制By3D BDPY 581/591 C11检测工作液时注意避光，且需现用现配，配制好的工作液必须一次使用完毕，不宜保存后使用。
- By3D BDPY 581/591 C11检测工作液中的BDPY 581/591 C11的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。BDPY 581/591 C11的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
- 染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D BDPY 581/591 C11检测工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育30分钟。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 为达到最佳的检测效果，BDPY 581/591 C11染色和药物诱导的先后顺序可以根据细胞种类、诱导剂的种类等实验条件进行调整，必要的情况下可以先进行对比测试，以确定较佳的实验条件、保证实验的顺利性。例如，对于3D培养的HCT-116细胞，通常染色后再进行药物诱导的检测效果较好。
- By3D BDPY 581/591 C11检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D BDPY 581/591 C11检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 阳性对照的设置：对于大多数细胞，BDPY 581/591 C11染色30分钟后，把试剂盒中提供的By3D LpoUp (500×)推荐按照1:500的比例加入到无血清细胞培养液中，处理细胞2小时。随后即可进行细胞内脂质过氧化产物的检测。对于大多数细胞，通常By3D LpoUp (1×)处理2小时后脂质过氧化产物含量大量增加，可观察到较强的绿色荧光，红色荧光减弱；而正常的细胞经BDPY 581/591 C11染色后应显示较强的红色荧光，绿色荧光较弱。对于特定的细胞，By3D LpoUp作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度作用时间，甚至某些细胞可能对By3D LpoUp不敏感。
- 荧光检测：
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液或诱导液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液或诱导液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(BDPY 581/591 C11的还原态产物最大激发和发射波长为581/591nm，经脂质过氧化物氧化后，激发和发射波长最大值偏移至约488/510nm。还原态时主要为红色荧光，此时红绿荧光比值较大，氧化态主要为绿色荧光，此时红绿荧光比值降低，可通过红绿荧光的比值确定脂质过氧化的程度)。通过对比对照组荧光探针的RFU，可以计算出细胞球内脂质过氧化产物的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液或诱导液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察效果。注意整个过程均需注意避光操作。
图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，吸除培养液后直接加入1×的By3D BDPY 581/591 C11检测工作液，染色30分钟后，使用1×By3D LpoUp (LpoUp)诱导细胞球2小时。结果显示，本试剂盒对于LpoUp诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，正常的HCT-116细胞中BDPY 581/591 C11以还原态形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光较弱(B、C)；使用脂质过氧化的阳性对照试剂LpoUp处理后，荧光发射波长峰值从约590nm偏移至约510nm，因此活细胞内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强(F、G)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
脂质过氧化(LPO)是许多病理状态的关键变化，会导致一些重要的膜蛋白结构和功能的改变，甚至导致细胞功能障碍和广泛的细胞和组织损伤，和许多疾病的发生密切相关。广泛的脂质过氧化是铁死亡的关键下游特征。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性、与细胞凋亡不同的细胞死亡形式。在二价铁的作用下，细胞抗氧化能力减弱，细胞膜或细胞器膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子被过氧化而破坏，造成细胞膜破裂，从而导致调节性细胞死亡(RCD)，也称程序性细胞死亡(PCD)。
BODIPY 581/591 C11是一种具有强紫外吸收能力的小分子染料，染料间干扰小，光谱很窄，染料分子不带电荷，呈中性，其荧光峰比较尖锐，量子产率高。与大多数长波长染料不同，BDPY荧光基团本质上是亲脂性的，所以可以模拟天然脂质的性质。该系列染料在不同生理条件下相对稳定，对环境的极性和pH值相对不敏感，由于其结构具有非对称性，故有多种衍生结构产物，BODIPY 581/591 C11即为其中一种。BODIPY 581/591 C11具有良好的光稳定性、低荧光伪影特质，可以快速入膜，是一种用于检测活细胞内脂质过氧化及抗氧化能力的荧光探针。其还原态和氧化态，均具有良好的亲脂性，二者处在磷脂双分子层的两个不同区域，均不会自发离开细胞膜磷脂双分子层。BODIPY 581/591 C11对各种氧自由基以及过氧亚硝酸盐灵敏，但对超氧化物、一氧化氮、过渡铁离子和氢过氧化物不灵敏。
BODIPY 581/591 C11的还原态产物最大激发波长为581nm，最大发射波长为591nm，主要为红色荧光，此时红绿荧光比值较大；经脂质过氧化氢物氧化后，激发和发射波长最大值偏移至约488/510nm，主要为绿色荧光，此时红绿荧光比值降低。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可，并可通过红绿荧光的比值确定脂质过氧化的程度。
BODIPY 581/591 C11基本化学信息如下：
| 别名 | BDPY 581/591 C11；BDPY 581/591十一烷酸； 脂质过氧化传感器；Lipid Peroxidation Sensor； 脂质过氧化探针；Lipid Peroxidation Probe |
| CAS号 | 217075-36-0 |
| 分子式 | C30H35BF2N2O2 |
| 分子量 | 504.42 |
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