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本制品是一种利用荧光探针CM-H2DCFDA进行3D培养的细胞球或类器官中活性氧检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官中活性氧检测。通常仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中活性氧绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

本试剂盒是3D细胞活性氧检测试剂盒(DCFH-DA，货号：YTC0816)的升级产品。CM-H2DCFDA是H2DCFDA的氯甲基衍生物，也称CM-DCFH-DA，其在活细胞中比H2DCFDA具有更好的滞留率，因此荧光信号更强，且更适合细胞内活性氧的相对较长时间的研究。CM-H2DCFDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成CM-H2DCF (也可称为CM-DCFH)。而CM-H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。CM-H2DCF的氯甲基可与细胞内谷胱甘肽或其它巯基发生反应从而具有更好的细胞内滞留性，后续细胞内的活性氧可以氧化无荧光的CM-H2DCF生成有荧光的CM-DCF，检测CM-DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/mL。本试剂盒同时提供了By3D CM-H2DCFDA Assay Buffer，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。

组分	200T	1000T
By3D CM-H2DCFDA (1000×)	20μL	100μL
Rosup (50mg/mL)	20μL	100μL
By3D CM-H2DCFDA Assay Buffer	20mL	100mL

保存：-20℃，避光，有效期1年。



图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，100μg/mL Rosup诱导细胞球2.5小时，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D CM-H2DCFDA检测工作液，染色20分钟。结果显示，By3D活性氧检测试剂盒(CM-H2DCFDA)对于Rosup诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D CM-H2DCFDA染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。3D细胞Hoechst 33342染色液需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

• 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
  
• 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
  
• 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
  
• 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  
• 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经活性氧诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
  
• 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。

• 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。如果后续用于荧光酶标仪检测，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
  
  • 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
• 装载探针：为达到最佳的检测效果，探针装载和药物处理的先后顺序可以根据细胞和诱导剂的种类、诱导时间长短等实验条件进行摸索和调整。对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。例如对3D培养的HCT-116细胞时，先用Rosup诱导2.5小时，再装载探针的效果较好。
  
  • 活性氧阳性对照(Rosup)推荐使用无血清细胞培养液进行稀释，以确保获得良好的诱导效果。对于目的药物，也可以酌情使用无血清细胞培养液进行稀释，以获得良好的诱导效果。
  • By3D CM-H2DCFDA检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D CM-H2DCFDA检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
    
  • By3D CM-H2DCFDA检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D CM-H2DCFDA检测工作液的量，用By3D CM-H2DCFDA Assay Buffer稀释配制适量的By3D CM-H2DCFDA检测工作液。
    

    样品数	10个样	50个样	100个样
    By3D CM-H2DCFDA (1000×)	1μL	5μL	10μL
    By3D CM-H2DCFDA Assay Buffer	1mL	5mL	10mL
    By3D CM-H2DCFDA检测工作液	~1mL	~5mL	~10mL

    • 配制By3D CM-H2DCFDA检测工作液时注意避光，且需现用现配，配制好的工作液必须一次使用完毕，不宜保存后使用。
    • By3D CM-H2DCFDA检测工作液中的CM-H2DCFDA的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。CM-H2DCFDA的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
  • By3D CM-H2DCFDA探针的装载：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D CM-H2DCFDA检测工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
    
    • 为达到最佳的探针装载效果，具体孵育时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
• 检测：
  
  • 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
    
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  • 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=490/530nm)。通过对比对照组荧光探针的RFU，可以计算出细胞球内活性氧的相对比例关系。对于3D细胞器或类器官，更推荐使用荧光显微镜进行观察和拍照。荧光酶标仪的检测，推荐作为快速检测和筛选用途。
    
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
• 其它说明：阳性对照Rosup可以按照1:500的比例使用无血清培养液稀释后使用。通常刺激后2～3小时内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照Rosup的效果可能有较大的差别。如果在刺激后2～3小时内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。对于特定的细胞，Rosup作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度和作用时间，甚至某些细胞可能对Rosup不敏感。
  另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000稀释CM-H2DCFDA，使装载探针时CM-H2DCFDA的浓度降低。
  探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。
  活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

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