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本制品一款便捷、高效的用于制备细胞3D培养用U形底96孔板，以支持细胞球体持续形成和培养的试剂盒。本试剂盒特别适用于提供细胞3D生长微环境，使各种细胞从单细胞悬液培养成细胞球，包括肿瘤球体(Spheroid)、肿瘤类器官(Organoid)、神经细胞球(Neurosphere)、白细胞球等。使用本制品包被的细胞培养板可生成大小比较均一的细胞球体，广泛应用于肿瘤研究、药物筛选、类器官构建及组织工程等领域。

本试剂盒提供3D细胞培养包被液和U形底96孔板用于细胞3D培养环境的构建。3D细胞培养包被液的主要成分是一种特殊的高分子多聚物，可作为非粘附性基质包覆容器，快速在容器表面形成一层亲水涂层，以抑制细胞粘附到容器的生长表面。本制品搭配使用96孔等细胞培养板，即可实现一致的、可重复的细胞3D生长，显著降低差异性。本制品包被细胞培养板的操作简单、易于上手，后续细胞培养的实验操作流程和传统的细胞培养实验基本相同。

• 本试剂盒操作简单、便捷。本试剂盒包含高品质可用于细胞培养的U形底96孔培养板，仅需1步即可完成3D细胞培养环境构建，即用3D细胞培养包被液对U形底96孔板进行包被，整个包被过程最少仅需约30分钟。包被后，按照常规的细胞培养方法接种和培养细胞，一般继续培养24～48小时即可获得相对较为紧密的细胞球，不同类型的细胞培养板细胞球的形成时间可能会有差别。细胞球体的大小可以通过细胞的初始接种密度来控制。
  
• 本试剂盒应用广泛，适用于大量常见细胞的3D培养，并且培养速度快。本试剂盒支持不同的细胞类型，不仅可用于HCT-116、HeLa等贴壁细胞的3D培养，也可用于K562、MOLM-13等悬浮细胞的3D培养。细胞接种于本试剂盒包被的U形底96孔板2小时就可以呈现出明显的聚集状态，随着培养时间的延长球体会越来越紧密。培养至48小时后，可形成一个比较紧实的细胞球，球体大小和接种的细胞数目成正比。而相较于U形底部结构，平底多孔板或培养皿一般需要3～5天以上才能培养成细胞球。

• 3D细胞培养包被液如果是-20℃保存，使用前须回复至室温。
  
• 3D细胞培养包被液含有一定浓度的乙醇，易挥发，在使用和储存过程中须密封。
  
• 3D细胞培养包被液加入U形底96孔板时应尽量避免出现气泡，如果不小心出现气泡，需要用枪头小心将气泡挑破，否则可能会影响U形底96孔板的包被效果，进而影响细胞的培养效果。
  
• 即时包被时，包被液加入培养板及吸去后的静置时间都必须长于10分钟，并尽量延长时间为佳，否则可能会影响培养效果。
  
• 3D细胞的成球速度、球体紧密度、以及球体的形态等和细胞种类、细胞数量密切相关，不同的细胞种类和细胞数量，3D细胞的成球速度及细胞球的状态可能会有较大的差别。
  
• 尽管本制品可以即时包被使用，但如果要获得更好的培养效果，建议提前包被并在干燥箱或烘箱中烘干液体，使用效果更好。烘干后的培养板如果不能立刻使用，应及时密封后存放在4℃，3个月内有效；如果存放于室温，一周内有效；如果37℃存放，一天内有效。

• U形底96孔板的包被：
  
  • U形底96孔板的即时包被。
    
    • 在超净工作台或生物安全柜内，向U形底96孔板每孔加入40μL包被液。
      
      • 加液时需避免出现气泡。
    • 盖上U形底96孔板盖子，放入二氧化碳培养箱静置至少10分钟。
      
      • 延长静置时间，效果会更佳。
    • 取出培养板，小心吸去包被液，避免触及底部包被区。
      
    • 培养板在超净工作台内继续静置干燥至少10分钟，然后进行细胞接种。
      
      • 延长静置干燥时间，效果会更佳。
  • U形底96孔板的提前包被。
    
    • 在超净工作台或生物安全柜内，向U形底96孔板每孔加入包被液40μL。
      
      • 加液时避免出现气泡。
    • 盖上U形底96孔板盖子，放入37℃干燥箱或烘箱过夜，直至孔板中的液体完全挥发。
      
      • 培养板在37℃干燥箱或烘箱中的干燥时间最好不要超过2天。请注意挥发出的主要是水和乙醇，须避免水和乙醇影响其它样品。
    • 取出培养板，进行细胞接种；如果培养板暂时不使用，可以放入自封袋或保鲜袋中密封后存放于4℃，通常3个月内有效。
• 细胞的3D培养：
  
  • 包被好的U形底96孔板，每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如细胞种类、细胞密度、培养天数、需要的3D细胞球体的大小等确定。
    
  • 细胞通常在接种2小时就呈现明显的聚集状态，培养24至48小时逐渐形成细胞球。
    
    • 具体的成球速度、球体紧密度、以及球体的形态等和细胞种类有关。
  • 球体形成后，可以使用适宜量程的移液器轻缓换液，保证细胞球的完整；也可以在孔板中吸出约一半体积的培养液，再加入与吸出体积等量新鲜的培养液，即采用半换液的形式，以免将细胞球吸走。
    
  • 根据实验需求，可以使用CCK-3D试剂盒或3D细胞活力检测试剂盒(发光法)检测细胞球的总体细胞活力，或者使用1mL的枪头吸取细胞球至离心管中，静置待细胞球沉降以后，移除上清，进行后续实验。
    
    • 细胞球尺寸为几十至数百微米，肉眼观察通常为针尖大小、乳白色。
    • 操作时尽量轻缓，以避免细胞球损伤或丢失。
    • 需确认细胞成球紧实后再进行后续实验。