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本制品是一种非常高效、便捷的对3D培养的细胞进行高质量、高透明度透明化处理的试剂盒。经本试剂盒透明化处理的3D细胞球，可以与后续的免疫荧光、免疫组化、常规或荧光染色、生物发光等结合起来，实现3D细胞球的三维成像，从而广泛用于生物、医学领域的研究。

• 适用范围广：本试剂盒可用于各种方法培养出的3D细胞球，包括细胞悬滴培养板、超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel基质胶或Matrigel包被的平板等。
  
• 操作简单便捷：使用本试剂盒提供的BalbCUBIC 3D Solution简单浸泡3D细胞球10分钟，就可以轻松实现3D细胞球的透明化，无需使用任何特殊的仪器或设备。
  
• 操作时间短：3D细胞球先经PFA固定液固定10分钟，固定结束后使用BalbCUBIC 3D Solution作用10分钟即可完成3D细胞球的透明化。
  
• 处理的3D细胞球透明度高：本试剂盒所使用的透明化试剂BalbCUBIC 3D Solution具有很强的脱色和脱脂能力，能有效实现3D细胞球的透明化。
  
• 兼容荧光蛋白和后续的荧光染色：本试剂盒在使用过程中可以充分保护荧光蛋白的稳定性，不会导致EGFP、EYFP、mCherry等荧光蛋白的变性而失去荧光。

传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反应细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。

• BalbCUBIC 3D Solution须-20℃避光保存，100×Wash Buffer可以4℃保存。
  
• BalbCUBIC 3D Solution使用前，需室温静置至完全融化，确保液体透明并且没有沉淀。如果有晶体析出或溶液不透明，可以短时间置于55℃水浴溶解至完全透明并且没有沉淀。
  
• BalbCUBIC 3D Solution在高温(>75℃)下失效，注意不可高温处理。
  
• BalbCUBIC 3D Solution处理后细胞球会变软，导致细胞球在外力的作用下容易变形或分散，所以在整个实验过程中请缓慢、小心进行，以免吹散细胞球。
  
• BalbCUBIC 3D Solution很容易清除掉油性笔迹。使用时请尽量盖紧盖子，并用Parafilm密封盖子，防止漏液。建议同时在管盖和管体上进行样品标记，以免样品信息丢失。
  
• BalbCUBIC 3D Solution处理过程中如果出现浓烈的氨气气味，提示溶液可能已经失效，请及时更换新鲜的BalbCUBIC 3D Solution，以免影响透明化效果。
  
• 为了保证BalbCUBIC 3D Solution长期有效，需要-20℃避光保存。但使用时，为了方便观察细胞透明化效果，可以在非严格避光条件下对样品进行透明化处理。

• 3D细胞的准备：使用适合进行3D细胞培养的超低吸附96孔板，每孔接种100μL细胞(如使用384孔板，每孔接种25μL细胞，具体用量视不同类型的384孔板而定)，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照，按照3D细胞培养方案培养细胞。如有需要，可加入药物处理细胞。
  
• 透明化试剂的准备：
  
  • 50% BalbCUBIC 3D Solution的配制：BalbCUBIC 3D Solution和超纯水按1:1的比例混匀，例如取1mL BalbCUBIC 3D Solution加入1mL超纯水中，混匀即得2mL 50% BalbCUBIC 3D Solution，室温避光可保存1个月。
    
  • 1×Wash Buffer的配制：将100×Wash Buffer和PBS按1:100比例进行稀释，例如取1mL 100×Wash Buffer加入99mL PBS中，混匀即得100mL 1×Wash Buffer，室温下可保存1～2个月。
• 3D细胞的固定：去除孔内培养基，适量的PBS洗涤细胞1～2次，去除PBS，每孔加入100μL 免疫染色固定液或PFA固定液或其它适当的固定液，在适宜于细胞培养的温度或室温固定细胞10分钟。
  
  • 为达到最佳的使用效果，具体的固定时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状体大小等进行调整。通常细胞球较大时，固定时间需要适当延长。
• 3D细胞的透明化：去除固定液，每孔加入100μL 1×Wash Buffer清洗细胞球2次，每孔加入100μL 50% BalbCUBIC 3D Solution，在适宜于细胞培养的温度避光孵育10分钟。
  
  • 为达到最佳的透明化效果，具体透明化时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。通常细胞球较大时，透明化时间需要适当延长。
• (选做)细胞核染色：去除50% BalbCUBIC 3D Solution，每孔加入100μL 1×Wash Buffer清洗细胞2次。使用3D细胞DAPI染色液或3D细胞Hoechst 33342染色液进行细胞核染色。
  
• (选做)免疫荧光染色：
  
  • 一抗孵育。用免疫染色一抗稀释液、FastBlock免疫染色一抗稀释液或其它适当的一抗稀释液按照一抗推荐的稀释比例进行稀释。37℃或室温摇床(60rpm)适当避光孵育1小时。如果一抗孵育1小时效果不佳，可4℃缓慢摇动孵育过夜。
    
    • 一抗稀释比例及孵育时间可以根据实际染色效果进行适当调整。
  • 回收一抗，每孔加入100μL 1×Wash Buffer，室温洗涤至少3次。
    
  • 二抗孵育。用免疫荧光染色二抗稀释液、FastBlock免疫荧光染色二抗稀释液或其它适当的二抗稀释液按照二抗推荐的稀释比例进行稀释。37℃或室温摇床(60rpm)避光孵育1小时。
    
    • 二抗稀释比例及孵育时间可以根据实际染色效果进行适当调整。
  • 回收二抗。
• 荧光拍摄：染色结束后，每孔加入100μL 1×Wash Buffer清洗细胞2次并换液，随后即可在荧光显微镜下观察。

• 3D细胞透明化过程中是否需要使用特殊类型的容器？
  无须使用特殊类型的容器。可以使用实验室常用的聚丙烯或聚乙烯类塑料器皿或玻璃器皿。
  
• 3D细胞在透明化过程中会膨胀吗？膨胀对实验有什么负面影响吗？
  3D细胞在透明化过程中很可能会膨胀。但这种膨胀是接近线性并且比较微弱均匀的，细胞相对位置是保持不变的。除了整体形态会微膨胀外，其它不会产生很明显的负面影响。
  
• 可以跳过固定步骤直接进行透明化吗？
  不可以。在未进行固定的情况下进行3D细胞透明化，可能导致细胞相对位置紊乱，也可能影响后续免疫染色等的效果。因此，在透明化之前需要先固定样本。
  
• 透明化的3D样品可以使用什么样的细胞核荧光染料？
  推荐使用3D细胞DAPI染色液或3D细胞Hoechst 33342染色液等。
  
• 是否需要购买特殊的抗体用于透明化处理后的样品？
  虽然许多蛋白质在固定、脂肪清除和脱色过程中不会失去其抗原性，但也有例外。建议最好对所使用的抗体进行适当验证。
  
• 可以使用荧光标记的二抗吗？
  可以。但考虑到样品中每个抗体孵育所需的时间，如能使用荧光标记一抗效果更佳。
  
• 可以兼容哪些荧光蛋白？
  本试剂盒具有较好的荧光蛋白兼容性，可以兼容GFP、EGFP、EYFP、mCherry和mKate2等常见荧光蛋白。
  
• 可以使用什么样的荧光染料？
  FITC、Rhodamine、Cy3、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647等常见荧光探针都是可以使用。