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本制品是一种化学成分确定，无血清或其它蛋白成分的即用型类器官细胞冻存液，可适用于多种来源的类器官细胞的冻存。本制品为百奥莱博BalbOrganoid类器官培养液系列产品的配套试剂。百奥莱博同时提供含有血清的类器官细胞冻存液。

本制品性能佳，可保持高细胞活性和回收率。本制品不含牛血清、无蛋白质成分、不含任何动物源性物质(AOF)，含DMSO。经测试，本制品有效提高了类器官细胞的冻存活率和细胞解冻后的回收率。

类器官通常指在体外显示出与体内器官或组织相似结构和功能的复杂三维(3D)结构，更严格的定义是指由干细胞或器官祖细胞发育而来的，作为体外平台模拟其对应器官的结构和功能等多个方面的3D细胞培养物。类器官在形成过程中，细胞自我组建并分化为功能型的微小细胞团，模拟真实器官发育，以与体内相似的方式由细胞分序与空间特异性的谱系分化调控，需激活由细胞内在成分和外在环境(细胞外基质、培养液等)介导的各种信号通路。

• 需自备细胞冻存盒、细胞冻存管、15mL离心管等。
  
• 请确保冻存前类器官或细胞生长情况良好，例如处于对数生长期的细胞，并且冻存时存活率大于90%。
  
• 实验过程中用于洗涤等步骤的类器官基础培养液也可以使用减血清DMEM/F-12培养基。
  
• 建议类器官或细胞冻存在液氮中，可以长时间进行保存。

• 类器官的冻存：
  
  • 将待冻存的类器官细胞按类器官的传代和扩增方法，从类器官基质胶悬滴中收集类器官并去除基质胶。
    
  • 如果从多孔收获并冻存类器官，则将多个生长状态类似的类器官沉淀加入类器官基础培养液重悬后集中到一个15mL离心管中，轻轻吹打混匀，300×g室温离心3分钟。
    
  • 每1×10⁶个活细胞或每100～200μL类器官/基质胶悬滴，用0.5～1mL无血清类器官细胞冻存液重悬沉淀。
    
  • 使用移液管将类器官重悬液按每管0.5～1mL分装至细胞冻存管中。
    
  • 将冻存管转移至细胞冻存盒中进行程序降温后转移至液氮罐中长期保存。类器官冻存时，程序降温速度以1℃/分钟为宜，并在-80℃放置至少24小时后转移至液氮中保存。
• 类器官的复苏：
  
  • 将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
    
  • 打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。
    
  • 将完全融化的细胞溶液转移至含有预热的10mL类器官基础培养液的15mL无菌离心管中，并额外使用1mL类器官基础培养液冲洗冻存管，合并冲洗液至15mL离心管中。
    
  • 300×g室温离心3分钟，吸除上清，注意不要吸走类器官细胞沉淀。
    
    • 离心管应置于冰上操作。
    • 如果在冻存时基质胶没有去除彻底，则在离心后可能存在一层混浊的基质胶。如果显微镜下没有观察到基质胶层中有大量的类器官细胞，应将基质胶层去除。反之，如果基质胶层中观察到类器官细胞，则需进行额外的清洗。额外的清洗步骤为加入10mL类器官基础培养液，吹吸混匀，然后重复步骤2d。
  • 将细胞沉淀使用基质胶重悬，参照类器官培养液的使用说明进行类器官培养，或根据后续实验需求，加入适量预热的对应类器官完全培养液重悬细胞，轻轻吹匀后转移至培养器皿中，放入细胞培养箱中培养。