本试剂盒是一种通过巢式PCR法(Nested PCR)检测培养细胞等生物材料中是否存在支原体污染的检测试剂盒。本试剂盒可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。
支原体(Mycoplasma)是最小、最简单的原核生物。支原体有如下特征：支原体无细胞壁结构，所以针对细胞壁的许多常见的抗生素，如青霉素或β-内酰胺类抗生素对支原体无效；支原体大小介于细菌和病毒之间，约为0.2～0.8μm，所以部分支原体可通过0.22μm滤器，常规的过滤对支原体无效；很多支原体由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供营养，所以通常吸附或散落在细胞表面和细胞之间。支原体的这些特征使细胞培养过程中存在支原体污染的风险，细胞的支原体污染已经成为一个世界性的普遍问题。
支原体污染可能会严重影响细胞的状态，使细胞的基因表达、代谢特征发生变化，导致细胞生长减缓、分化和死亡异常，严重影响细胞功能。这些影响因素会严重影响实验结果的可靠性、可重复性和一致性，因此支原体污染的检测非常重要。
细胞培养过程中的细菌、酵母或霉菌污染在光学显微镜下可见，但支原体污染在光学显微镜下通常不可见，必须通过特定的检测方法进行检测。检测支原体污染的常用方法有支原体分离培养、ELISA、发光法等特殊的生化检测以及DNA荧光染色检测等。上述检测方法中，大多操作步骤相对比较烦琐、灵敏性不高、不能区分支原体种类、需要特殊仪器或所需时间较长。而PCR法操作相对比较简单便捷，PCR扩增后通过电泳分析即可确定是否有支原体污染，并可根据扩增片段的大小大致预测至少11种所污染的支原体种属。如果有必要，也可以对PCR产物进行常规测序以确定具体的支原体种属。
本支原体PCR检测试剂盒是利用两对引物通过巢式PCR法特异性扩增支原体基因组DNA片段，从而实现对支原体的高灵敏度特异性检测的。原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区(space region)在各种生物种间的碱基序列差别很大，如16S和23S之间的间隔区。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种属间既有非常保守的部分，也有较大差异的部分。在编码16S和23S的保守区DNA上设计一对F1/R1引物，用于扩增16S和23S之间的间隔区，这就是巢式PCR的第一轮PCR (1st PCR)，用于初步鉴定是否有支原体污染；然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条F2引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条R2引物进行巢式PCR的第二轮PCR (2nd PCR)。通过巢式PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度。本产品的检测原理请参考图1。
图1.支原体PCR检测试剂盒的检测原理图。
本试剂盒提供了阳性对照Control template，便于确定PCR检测是否能正常工作，及样品中是否存在抑制PCR反应的物质。
如果发现有支原体污染，建议更换无污染的细胞进行培养。如果有必要预防或去除支原体，可以使用专用的支原体预防或去除试剂(货号：YT987、YT988)。
| 组分 | 规格 |
| 1st PCR Primer Mix (50X) | 100μL |
| 2nd PCR Primer Mix (50X) | 100μL |
| Control template | 100μL |
保存：-20℃
- 由于PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
- 一般情况，1st PCR可以初步鉴定是否有支原体污染，但建议进行2nd PCR以进一步确认。
- 本试剂盒不能检测出人肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
- 实验前的准备工作：
- 1st PCR反应：
- 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2×PCR MasterMix(货号：YT378)，例如2×LoadEasy PCR MasterMix(货号：YTB4095)置于冰浴上或冰盒内。参考下表在冰浴上设置PCR反应：
成分 20μL体系 50μL体系 终浓度 双蒸水或超纯水 7.6～9.2μL 19～23μL - 检测样品(DNA)或Control template 0.4～2μL 1～5μL 0.2pg/μl～20ng/μl 1st PCR Primer Mix (50X) 0.4μL 1μL 1X 2×LoadEasy PCR Master Mix (Green) 10μL 25μL 1X 总体积 20μL 50μL -
注：Control template的推荐用量为1μL。 - PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
STEP1 (起始变性):94℃ 30sec
STEP2 (变性):94℃ 30sec
STEP3 (退火):55℃ 2min
STEP4 (延伸):72℃ 1min
STEP5 (循环):Go To STEP2 for 30-35 cycles
STEP6 (最终延伸):72℃ 5min
STEP7 (临时保存):4℃ forever
- 融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2×PCR MasterMix(货号：YT378)，例如2×LoadEasy PCR MasterMix(货号：YTB4095)置于冰浴上或冰盒内。参考下表在冰浴上设置PCR反应：
- 2nd PCR反应：
- 参考下表在冰浴上设置PCR反应：
成分 20μL体积 50μL体积 终浓度 双蒸水或超纯水 9.4μL 23.5μL - 1st PCR产物 0.2μL 0.5μL 0.2pg/μl～20ng/μl 2nd PCR Primer Mix (50X) 0.4μL 1μL 1X 2×LoadEasy PCR Master Mix (Green) 10μL 25μL 1X 总体积 20μL 50μL - - PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
STEP1 (起始变性):94℃ 30sec
STEP2 (变性):94℃ 30sec
STEP3 (退火):55℃ 2min
STEP4 (延伸):72℃ 1min
STEP5 (循环):Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6 (最终延伸):72℃ 5min
STEP7 (临时保存):4℃ forever
- 参考下表在冰浴上设置PCR反应：
- 扩增产物的电泳分析：
- 反应结束后，取1st PCR及2nd PCR的反应产物各10μL，进行电泳确认扩增有无片段及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果示意图请参考图2。如果实验目的只是确定是否有支原体污染，1～2%的琼脂糖凝胶电泳均可；如果需要确定片段大小并据此大致推测污染支原体的种类，优先推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。
图2.使用本支原体PCR检测试剂盒进行PCR检测时扩增产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。1、2、3是1st PCR产物；1#、2#、3#是相应的2nd PCR产物。各泳道的模板分别是：1和1#，Control template；2和2#，支原体污染的细胞上清；3和3#，超纯水。M为DNA marker。 - 以不同种属的支原体为模板，1st PCR及2nd PCR的反应产物的条带大小不同，具体扩增片段大小可参考下表。
本试剂盒确定可以扩增的支原体种类及1st PCR和2nd PCR扩增产物长度参考表：种属 GenBank编号 1st PCR (bp) 2nd PCR (bp) Mycoplasma arginini JN935883 370 145 Mycoplasma arthritidis AY973560 408 157 Mycoplasma capricolum AY800346 415 221 Mycoplasma fermentans AY816338 492 195 Mycoplasma hominis AY738737 370 148 Mycoplasma hyopneumoniae JN935889 682 238 Mycoplasma hyorhinis AY973572 452 211 Mycoplasma neurolyticum AY796063 502 196 Mycoplasma orale AY737010 424 179 Mycoplasma pulmonis JN935865 477 190 Mycoplasma salivarium AY786574 403 151 Ureaplasma urealyticum AY741673 482 154
注：本试剂盒主要用于检测是否有支原体污染，但也可以通过1st PCR和2nd PCR扩增产物长度大致预测所污染的支原体种属。如果有必要，也可以对PCR产物进行常规测序以确定具体的支原体种属。
- 反应结束后，取1st PCR及2nd PCR的反应产物各10μL，进行电泳确认扩增有无片段及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果示意图请参考图2。如果实验目的只是确定是否有支原体污染，1～2%的琼脂糖凝胶电泳均可；如果需要确定片段大小并据此大致推测污染支原体的种类，优先推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。
- 关于阳性对照反应：
- 一方面阳性对照Control template可以单独使用，以确定PCR反应体系是否能正常工作。另一方面，阳性对照Control template也可以添加到样品中，以确定样品中是否含有抑制PCR反应的物质。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template时，1st PCR的反应产物是810bp，2nd PCR的反应产物是590bp。
- 如果阳性对照Control template单独使用时没有获得扩增片段，提示PCR检测体系存在问题，需要考虑更换PCR反应相关试剂。
- 如果阳性对照Control template单独使用时获得了预期的扩增片段，而阳性对照Control template添加到样品一起进行PCR扩增反应时没有获得任何PCR扩增产物，提示PCR体系工作正常，但检测样品中存在抑制PCR反应的物质。此时建议将检测样品进行DNA抽提，再用提取的DNA作为模板进行扩增。也可以尝试将样品用超纯水或PBS适当稀释后再进行测试，此时如果样品中支原体的污染程度比较高，基本上不会影响检测，但如果样品中支原体的污染程度比较低，很可能会导致检测灵敏度显著下降。
- 如果阳性对照Control template单独使用时获得了预期的扩增片段，而阳性对照Control template添加到样品一起进行PCR扩增反应时可能仅获得支原体的PCR扩增产物或仅获得阳性对照Control template的扩增产物，也可能同时获得支原体和阳性对照Control template的扩增产物。其中一种模板量比较多时，通常更容易扩增获得哪种模板的PCR扩增产物。其中一种模板特别多时，另外一种模板可能检测不到明显的扩增。
- 一方面阳性对照Control template可以单独使用，以确定PCR反应体系是否能正常工作。另一方面，阳性对照Control template也可以添加到样品中，以确定样品中是否含有抑制PCR反应的物质。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template时，1st PCR的反应产物是810bp，2nd PCR的反应产物是590bp。
相关搜索：支原体检测试剂盒(巢式PCR法)，PCR法支原体检测试剂盒，支原体检测试剂盒，支原体PCR检测试剂盒，Mycoplasma PCR Detection Kit