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本产品是一种适合于把DNA转染到培养的真核细胞中的转染试剂盒。基于DEAE-dextran的细胞转染方法不仅可以转染贴壁细胞，也可以转染悬浮细胞。转染效率可以通过转染表达EGFP或其它荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。

关于DEAE-dextran的细胞转染方法早在1968年就有相关论文发表。DEAE-dextran可以促使DNA结合到细胞膜上，然后通过内吞作用(endocytosis)进入细胞。基于DEAE-dextran的细胞转染方法适用于瞬时转染(transient tranfection)，但不适用于筛选稳定表达细胞株。DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。

目前基于DEAE-dextran的细胞转染方法有两种，一种方法为把DNA和DEAE-dextran混合后加入到细胞中，另一种方法为先用DEAE-dextran预处理细胞，然后再加入DNA。后一种方法是在前一种方法的基础上经过改进而产生的，对于一些细胞包括Hela、COS、NIH3T3和KB细胞等，后一种方法可以增加细胞对DNA的摄入量，显著改善转染效果。氯喹的加入可以抑制溶酶体对外源DNA的降解，从而提高转染效率。但对于具体的细胞、具体的培养条件，如需获得更加理想的转染效率，必须自行摸索上述各种转染方法，找出优化的转染方法。

• 使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒，可以使用百奥莱博的质粒大量抽提试剂盒(货号：YT003)进行抽提，以保证获得较高的转染效率。
  
• 转染前细胞必须处于良好的生长状态。
  
• 试剂盒中各试剂均经过无菌处理，可以直接使用。在细胞转染过程中要严格注意无菌操作。
  
• 需自备用于洗涤的PBS或HBSS，以及用于稀释10×PBS的无菌水。
  
• 稀释或配制DEAE-Dextran溶液或DNA的1×PBS可以用试剂盒中提供的10×PBS稀释。
  
• 氯喹溶液对人体有害，请注意适当防护。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• DEAE-Dextran常规转染方法
  
  • 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作)：
    在转染前一天(20～24小时)把约20～60万细胞(具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定)培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约40～70%满。
    
  • 混匀试剂盒中各试剂。取适量10×PBS，稀释为1×PBS。37℃预热自备洗涤液(PBS或HBSS)。
    
  • 参考下表，对于待转染的六孔板中一个孔的细胞，依次加入适量1×PBS，2μg DNA，以及8μL DEAE-Dextran溶液，使最终体积为170μL，用枪轻轻吹打混匀。
    注意：不宜Vortex或离心。
    

    	One well for 6-well plate	One well for 24-well plate	60mm dish	100mm dish
    1×PBS	(162-x)μL	(40-x)μL	(325-x)μL	(540-x)μL
    DNA	xμL(2μg)	xμL(0.5μg)	xμL(4μg)	xμL(7μg)
    DEAE-Dextran溶液	8μL	2μL	17μL	28μL
    总体积	170μL	42μL	342μL	568μL
    均匀滴加到细胞表面，细胞培养箱内孵育30分钟，孵育期间经常摇动培养板以保持所有细胞湿润
    添加细胞培养液量	1.7mL	0.4mL	3.5mL	6mL
    添加氯喹溶液量(选做)	17μL	4μL	35μL	60μL
    细胞培养箱内培养不超过2.5小时或出现细胞毒性前更换培养液，继续培养48～72小时

    
    注1：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA用量可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
    注2：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以大致按照细胞培养面积按比例进行换算。
    
  • 去除细胞培养液，用PBS洗涤细胞2～3次，吸除残留液体。
    
  • 把170μL DEAE-Dextran-DNA混合物均匀滴加到细胞表面。
    
  • 细胞培养箱内孵育30分钟，孵育期间经常摇动培养板以保持所有细胞湿润。
    
  • 参考上表，每孔缓慢加入1.7mL细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA混合物体积的10倍)。
    
  • 选做：参考上表，每孔加入17μL氯喹溶液。氯喹溶液可以和上一步骤中1.7mL细胞培养液预先混合后一起加入。
    
  • 细胞培养箱内培养不超过2.5小时或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜细胞培养液继续培养。
    
  • 通常转染后48～72小时可以检测转染效果。
• DEAE-Dextran预处理转染方法
  
  • 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作)：
    在转染前一天(20～24小时)把约20～60万细胞(具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定)培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约40～70%满。
    
  • 混匀试剂盒中各试剂。取适量10×PBS，稀释为1×PBS。37℃预热自备洗涤液(PBS或HBSS)。
    
  • 参考下表，取适量试剂盒中提供的DEAE-Dextran溶液用1×PBS稀释10倍。对于六孔板的一个孔，取0.1mL DEAE-Dextran溶液，加入0.9mL 1×PBS，混匀。
    
  • 参考下表，取适量DNA用1×PBS稀释。对于六孔板的一个孔，取2μg DNA，加入适量1×PBS使最终体积为162μL。
    

    	One well for 6-well plate	One well for 24-well plate	60mm dish	100mm dish
    1×PBS	0.9mL	225μL	1.8mL	3.6mL
    DEAE-Dextran溶液	0.1mL	25μL	0.2mL	0.4mL
    稀释的DEAE-Dextran溶液	1mL	250μL	2mL	4mL
    DNA	xμL(2μg)	xμL(0.5μg)	xμL(4μg)	xμL(7μg)
    1×PBS	(162-x)μL	(40-x)μL	(325-x)μL	(540-x)μL
    稀释的DNA	162μL	40μL	325μL	540μL
    去除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤两次，每次3～5分钟
    加入稀释的DEAE-Dextran溶液，室温孵育9分钟，洗涤两次
    把稀释的DNA均匀滴加到细胞表面，孵育30分钟，孵育期间经常摇动培养板以保持所有细胞湿润
    添加细胞培养液量	1.7mL	0.4mL	3.5mL	6mL
    添加氯喹溶液量(选做)	17μL	4μL	35μL	60μL
    细胞培养箱内培养不超过2.5小时或出现细胞毒性前更换培养液，继续培养48～72小时

    
    注1：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA用量可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
    注2：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以大致按照细胞培养面积按比例进行换算。
    
  • 去除细胞培养液，用PBS或HBSS室温洗涤两次，每次3～5分钟。
    
  • 去除洗涤液，加入1mL经10倍稀释的DEAE-Dextran溶液，室温孵育9分钟。
    
  • 去除稀释的DEAE-Dextran溶液，用PBS或HBSS轻轻洗涤细胞两次。洗涤时要特别小心，经DEAE-Dextran预处理后贴壁细胞容易脱落。
    
  • 去除洗涤液，把步骤2d准备的162μL含有2μg DNA的1×PBS溶液，均匀滴加到细胞表面。
    
  • 细胞培养箱内孵育30分钟，孵育期间经常摇动培养板以保持所有细胞湿润。
    
  • 参考上表，每孔缓慢加入1.7mL细胞培养液(约稀释的DNA体积的10倍)。
    
  • 选做：参考上表，每孔加入17μL氯喹溶液。氯喹溶液可以和上一步骤中1.7mL细胞培养液预先混合后一起加入。加入氯喹后，
    在4小时内或出现明显的细胞毒性前必须更换新鲜细胞培养液。氯喹的具体处理时间，对于不同的细胞需根据实验操作结果进行确认。
    
  • 通常转染后48～72小时可以检测转染效果。

• 转染效率低或几乎没有转染。
  很多时候是由于过多细胞死亡导致。可以考虑适当减少DEAE-Dextran溶液的用量，或适当缩短细胞暴露于DEAE-Dextran的时间；减少氯喹溶液的处理时间；一些对DEAE-Dextran特别敏感的细胞，在转染时可以适当增加细胞密度。优化DNA的用量通常可以获得较高的转染效率。另外，确保DNA的纯度，例如确保A260/A280>1.8，可以改善转染效率。
  
• 转染效率不稳定。
  如果有支原体污染通常会导致转染效率不稳定，此时只需更换没有污染的细胞就可以了。另外，细胞生长状态不佳，也容易导致转染效率显著下降。