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本试剂盒应用蛋白酶的消化作用和非酶的化学作用使组织中细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液。制备的细胞悬液可用于原代培养、流式细胞仪进行细胞生物学(如凋亡、增殖、细胞周期等)研究、细胞胞内酶学测定、信号传递分子、代谢、蛋白或DNA提取、Western Blot、2D-胶、ELISA、、蛋白质组学等研究。

1. 组织取材需新鲜、无菌、操作轻柔防止机械损伤、尽量去除无用组织、避免干燥；
   
2. 充分漂洗去除血清及离子，以避免其影响消化酶的活性；
   
3. 消化酶不宜浓度过高、时间过长，避免对细胞产生毒性反应及消化产生多种杂质细胞；
   
4. 消化后尽量去除消化液，以防止毒性作用，并且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失；
   
5. 部分分离的细胞如需进一步培养，请参照相关文献的细胞培养条件；
   
6. 如果消化不完全或细胞被损伤，应根椐情况相应调整消化液的浓度、消化时间或消化温度，除表1推荐的消化条件之外，亦可参考表2及表3来建立适合各自样本的消化条件。

1. 组织直接消化法
   
   1. 无菌的解剖剪将实体组织剪成2～3mm3小块(至少0.5～1cm3)或糊糜状；
      
   2. 加入适量漂洗液漂洗三次，每次尽量除去漂洗液；
      
   3. 用稀释液将消化酶A稀释成一定浓度的消化酶A工作液，在组织中加入适量的消化酶A工作液消化，加入量以组织块完全没入为宜，37℃消化若干分钟至数小时；
      注：不同组织或细胞类型所用消化酶A工作液浓度、消化时间及温度均不尽相同，请参考表1。
      
   4. 选作步骤：对于较难消化的硬组织或上述消化液A过滤后的残块可进行二次消化或多次消化，每次加入与消化酶A工作液等体积的消化液B，37℃消化20～60分钟；
      
   5. 静置后小心弃去消化液上清，轻轻加入少许清洗液(可加入0.25%小牛血清)漂洗三次；
      
   6. 机械分散，用吸管吹打或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使组织分散，用100～200目不锈钢网或铜网或尼龙网(细胞筛)研磨过滤；
      
   7. 吸上述滤液，1500 r/min离心2min，弃上清。沉积细胞加入适量清洗液同样清洗、离心三次；
      
   8. 沉淀加入适宜的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，显微镜计数后，进行进一步接种培养或其它研究。
2. 灌注消化方法
   除上述直接消化法之外，某些组织(肝、内皮、心肌等)可采用下述灌注消化方法：
   
   1. 肝细胞
      实验动物以乙醚麻醉，无菌操作下开腹，暴露门静脉与下腔静脉，行门静脉穿刺，用预温37℃的漂洗液进行原位灌注。待肝脏充盈后剪开下腔静脉，放尽积血积液后用血管钳关闭血管。如此反复灌注20min，至肝脏表面湿润变软，呈现黄白色时停止，用消化酶A工作液(终浓度3mg/mL)灌注保留10～20min，取下肝脏置培养皿中，剪成乳糜状，37℃消化30min，用适量的清洗液(可事先加入0.25%的小牛血清)清洗后，200目滤网研磨过滤，吸取滤液，500 r/min离心2min，弃上清。沉积的细胞再以同样条件清洗、离心2～3次。最后以RPMI-1640制成细胞悬液备用。
      
   2. 内皮细胞
      内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，用三通注射器吸取温漂洗液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入消化酶A工作液(终浓度为5mg/mL)，充满血管，消化3～10min；注入口用线绳扎，以防液体返流。吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温清洗液轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中(此步骤可重复)。离心去上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养。
      
   3. 心肌细胞
      大鼠常规方法开胸，行胸主动脉插管，Langendorff离体心脏灌流装置用漂洗液逆灌，恒温37℃灌注10～15分钟直至心脏停跳，用消化酶A工作液(终浓度5mg/mL)灌注约20min，停灌后剪下左右心室，剪成1.5mm3左右的小块，置于细胞分离钢网筛(60目)研磨过滤，滤液离心(700 r/min离心1min，沉淀用清洗液与适当培养液(3∶1)的混合液离心洗涤4～5次，悬液再悬浮于3%-6%BSA上梯度离心(700 r/min离心1min，二次)，沉淀含有10%小牛血清的培养液重悬，接种培养。