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转膜孵育液主要用于明胶酶谱实验中凝胶的孵育。明胶酶谱法是一种检测明胶酶(例如基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9)活性的方法。活性明胶酶可消化包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的明胶。考马斯染色后，在深色背景上可见清晰的条带，表明降解的区域。该方案可检测条件培养基中分泌的MMP-9和MMP-2活性。

• 将细胞培养瓶加入10mL无血清DMEM，放入37℃培养箱中过夜24h。
  
• 于24h后收集上清液，将上清液离心2000rpm 10min，取上清，取出死细胞和杂质，放入-20℃储存备用。
  
• 对条件培养基进行蛋白定量，用无血清DMEM进行稀释，使蛋白定量保持蛋白浓度一致，制成样本。
  
• 加入5×上样缓冲液，使样本稀释为1×。
  
  • 配制25mL的5×上样缓冲液
    

    成分	用量
    4% SDS	1g
    20%甘油	5mL
    0.01%溴酚蓝	2.5mg
    125mM Tris-HCl	0.491g
    H2O	20mL

• SDS-PAGE凝胶配制
  
  • 1%明胶配制：取1g明胶于37℃下溶于100mL去离子水，制成后可保存于4℃，一周内使用。
    
  • 配制10mL分离胶(0.1%)
    

    成分	用量
    去离子水	1.7mL
    30%Acr-bis(29:1)	3.3mL
    1M Tris,PH8.8	3.8mL
    10% SDS	0.1mL
    10% AP	0.1mL
    TEMED	0.4μL
    1%明胶	1mL

    
    
  • 配制2mL压缩胶(5%)
    

    成分	用量
    去离子水	1.4mL
    30% Acr-bis(29:1)	0.33mL
    1M Tris,pH6.8	0.25mL
    10% SDS	20μL
    10% AP	20μL
    TEMED	2μL

• 电泳
  按每孔10μL进行加样，然后150V下电泳至条带完全分离(大约1.5h)。

• 将凝胶置于洗脱液中，洗脱液末过胶面，振荡洗脱2次，每次40分钟。
  
• 凝胶置于孵育液中37℃孵育40小时。
  
• 将孵育好的凝胶置于染色液(如FastBlue蛋白快速染色液)中染色。