细胞内pH检测试剂盒(红色荧光)

产品货号：

HR9108

中文名称：

细胞内pH检测试剂盒(红色荧光)

英文名称：

产品规格：

50T|100T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本试剂盒采用BalBcellProbe P06细胞内pH值荧光探针检测胞内pH值的变化。BalBcellProbe P06是pH敏感的荧光染料，其在碱性条件下荧光强更高，反之酸性条件下变低，从而BalBcellProbeTM P06可被用于监测细胞内pH变化。

检测原理：

BalBcellProbe P06是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BalBcellProbe P06本身没有荧光，穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成荧光物质，从而被滞留在细胞内。产生的荧光物质最大激发波长为488nm，最大发射波长为640nm，其在不同的pH值条件下发射的荧光强度不同，从而可以反映细胞内pH值得变化情况。

BalBcellProbe P06主要用于哺乳动物细胞的研究，也可用于其他动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中也可应用。实际检测时推荐使用的激发波长为488～530nm左右，发射波长为640nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内pH值的变化。

图一、BalBcellProbe P06检测原理图

光谱特性：

图二、BalBcellProbe P06荧光光谱

特别说明：

本试剂盒主要用于细胞内pH值变化的定性检测。如果需要测定细胞内pH值数值，可以选择细胞内pH值检测试剂盒(货号：HR0958)。

背景资料：

细胞内pH是酶活性和细胞功能的重要生理决定因素，所有蛋白质都依赖于严格调节的pH值以维持其结构和功能。质子-去质子化可以指示生物表面的电荷，并且是许多代谢反应中的组成部分。此外，跨线粒体膜的质子梯度用于产生细胞能量并支持其他线粒体过程。因此，细胞已经开发出多种机制来保持pHi的窄范围，以响应pH值的细胞内和细胞外波动。

产品组成：

组分	50T	100T
BalBcellProbe细胞内pH荧光探针P06	50μL	50μL×2
探针稀释液	10mL	10mL

保存：探针置于-20℃，稀释液置于4℃，有效期6个月。

保存事项：

探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
BalBcellProbe P06探针容易受潮，受潮后稳定性较差，注意干燥保存。
吸取BalBcellProbe P06探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。
未使用完的BalBcellProbe P06探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完！

规格说明：

本试剂盒内P06探针母液500～5000倍稀释后使用，一般1000～2000倍稀释使用即可，按每个样500μL计算，50μL母液至少可以做100～200个样品。

用户自备：

仪器准备：流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦、离心机、移液器、冰箱、冰盒
试剂准备：HBSS（含钙镁葡萄糖，不含酚红）、HEPES、1×PBS缓冲液（pH7.4）
耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

注意事项：

螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
pH探针为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
BalBcellProbe P06探针容易受潮，受潮后稳定性较差，注意干燥保存。
吸取BalBcellProbe P06探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。
未使用完的BalBcellProbe P06探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
BalBcellProbe P06探针工作液含水，配制后不可以长期保存，须现配现用。
细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
染色后立即进行分析。
可以在染色溶液中加入等体积的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127可以帮助BalBcellProbe P06更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存BalBcellProbe P06溶液。

使用方法：

染色工作液的配制：
根据样品数，用探针稀释液将P06探针进行10倍稀释，然后再用HBSS缓冲液稀释BalBcellProbe P06溶液20倍～200倍，配制成BalBcellProbe P06染色工作液。
- 推荐该探针工作液加载浓度是试剂盒中探针母液200～2000倍稀释，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。一般起始浓度用1000倍稀释即可。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。不同细胞需要的浓度不同。我们在测试中最低用到过20000倍稀释使用而仍然有良好的荧光信号。
- 也可以不用试剂盒中提供的探针稀释液稀释探针，直接用HBSS缓冲液稀释。也可以用不含血清的培养基直接稀释探针。稀释后工作浓度是试剂盒中探针母液200～2000倍稀释。
- 不能用含血清的培养基稀释探针。
- 也可以用以下缓冲液稀释后用于染色，直接将pH探针加入，终浓度在200～2000倍稀释即可。最佳的稀释液应能兼顾两方面——染料加载和良好的细胞反应。可能的选择有：1×HBSS + 20mM HEPES；1×HBSS + 20mM HEPES +1% BSA。
- 优化细胞种板的密度是很有必要的，保证了过夜培养后每孔可以形成密度相似的均一单细胞层。通过适当的调整种板时的密度，细胞可以培养超过一天来达到实验当天的要求。粘附性弱或生长不规则的细胞最好在用多聚赖氨酸、层黏蛋白或胶原蛋白包被过的多孔板中培养。
将BalBcellProbe P06染色工作液加入已处理好的细胞，在37℃孵育30～60分钟。
- 最佳的孵育时间取决于细胞类型。由于荧光染料对细胞是有毒的，所以要严格控制孵育时间。45分钟、37℃是通常对大多数细胞都有效的孵育条件，一般也作为方法摸索时的起始推荐条件。如果孵育30分钟可以得到一个可接受的荧光信号，建议采用更短时间的孵育条件。
- 关于阴离子交换蛋白抑制剂：一些类型的细胞通过阴离子交换蛋白转移阴离子至细胞外，这些阴离子包含了P06荧光染料。这样不仅仅导致了染料加载效果的减弱，同时导致了最终数据结果的误差；丙磺舒是一种阴离子交换蛋白抑制剂，被加入到加载培养基中后可以增加染料保留在细胞内的比例。已知的一个需要丙磺舒的细胞类型是CHO。尽管丙磺舒可以延缓染料从细胞内被转移至胞外，但其对细胞来说有一定的毒性，因此染料加载后的孵育时间应尽可能控制在最短时间内。丙磺舒一般不需要使用，有条件则使用。
用PBS或HBSS洗涤细胞2～3次。用HBSS重悬细胞。
然后用该细胞进行荧光细胞内pH变化情况检测。
- 激发波长488～530nm，发射波长640nm。
- 荧光强度增加则细胞内pH值增加，荧光强度降低则细胞内pH值下降。

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